来源：期刊VIP网 时间：
作者：陈千林;杨睿;徐登峰;牟豪;周杰;杨柳;郭庆勇;付利芝;
单位：国家生猪技术创新中心疫病防控研究院;新疆农业大学动物医学学院;重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所;
摘要：旨在建立一种定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）和传染性胃肠炎病毒（TGEV）的双重微滴数字PCR (dd PCR)检测方法。根据PEDV M基因（登录号：KX852340.1）和TGEV O RF 1b基因（登录号：DQ811785.1）保守序列分别设计特异性检测引物和探针，通过优化反应体系和扩增条件，建立了一种同时定量检测PEDV和TGEV的双重ddPCR检测方法。为探究该方法的检测性能，分别开展了特异性、灵敏性、稳定性，以及临床样品检测符合性等试验。结果显示：当引物浓度分别为900 nmol/L、探针浓度分别为250和300 nmol/L、退火温度为59.5℃时，ddPCR的扩增效果最优，阴、阳性微滴分布清晰，且阳性微滴分布最集中；该方法对PEDV和TGEV均具有良好的特异性，与猪场常见的猪丁型冠状病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪A群轮状病毒和伪狂犬病毒等病原均无交叉反应；对标准质粒pMD-M128和pMD-T116线性模板的检测极限分别为1.8和1.4 copies/反应；组内和组间重复变异系数为3.01%～15.05%；此外，国标（GB/T 36871—2018）和qPCR检出的阳性样本均包含于ddPCR方法中，PEDV检出率40.83%(49/120),TGEV检出率4.17%(5/120)，其中1份呈混合阳性。结果表明，建立的双重ddPCR特异、灵敏、稳定，可同时用于PEDV和TGEV的定量检测和鉴别诊断，为监测早期感染及标定核酸标准品提供了一种候选方法。
关键词：猪流行性腹泻病毒;;传染性胃肠炎病毒;;数字PCR;;检测方法
基金资助：重庆英才计划“包干制”项目（cstc2022ycj-hbgzxm0183）;; 国家生猪技术创新中心先导科技项目（NCTIP-XD/B11）;; 重庆市财政资金项目（25509C）
