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作者：李润茁;程莉;侯文哲;郭小娟;黄文荣;鲁茁壮;
单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室;中国人民解放军总医院第五医学中心血液病医学部;
摘要：第三代腺病毒载体较第一、第二代具有优势，本研究拟建立一种第三代腺病毒载体靶向性改造的技术方案。扩增纯化辅助病毒H14，制备其基因组DNA;PCR扩增含有质粒骨架的DNA片段，二者通过Gibson组装得到含有H14基因组的质粒pKH14。再利用前期建立的限制性酶切-组装（Restriction-assembly）方法，将pKH14质粒中的人5型腺病毒（HAdV-5）fiber knob编码序列替换为禽1型腺病毒CELO的fiber1对应序列，得到腺病毒质粒pKH14-CF1K。Pac I酶切线性化pKH14-CF1K，转染293细胞，拯救、扩增并纯化新的辅助病毒H14-CF1K。Pac I酶切线性化第三代腺病毒载体质粒pK4HSU-GFP，转染293Cre4细胞，在转染后5 h，添加H14-CF1K辅助病毒，拯救获得第三代腺病毒载体CF1K-GFP。利用H14-CF1K辅助病毒和293Cre4包装细胞，传代扩增CF1K-GFP，采用氯化铯密度梯度离心法进行纯化。对纯化的CF1K-GFP进行了鉴定，并检测了其对禽LMH细胞和人293细胞的基因转导能力。本研究建立了第三代腺病毒载体靶向性改造的技术平台，并获得能够有效转导禽LMH细胞的第三代腺病毒载体。
关键词：第三代腺病毒载体;Gibson DNA组装;病毒拯救
基金资助：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所青年科学基金项目（项目号：IVDC-202305）,题目：以猴1型腺病毒为载体的新型黏膜疫苗递送系统研究; 国家重点研发计划（项目号：2023YFC2307901）,题目：非复制型病毒载体的平台体系建立~~
