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作者：黄拓欣;李程;李汶洁;吴珺;陈凝雪;孙媛;
单位：华南农业大学动物科学学院畜禽健康养殖与疾病防控研究室;
摘要：为对猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）复制过程中基因组正负链RNA进行定量检测，以实现更好地了解SADS-CoV的复制和转录机制。本研究根据SADS-CoV N基因序列，通过生物学软件SnapGene和Primer Premier 6.0设计含有非病毒核苷酸标签序列的链特异性引物，建立了针对SADS-CoV N基因不同链RNA的链特异性实时荧光定量PCR(Strand-specific real-time fluorescence quantitative PCR,ssRT-qPCR)检测方法，并对其敏感性、重复性、特异性进行评估，同时对不同剂量SADS-CoV感染细胞后病毒复制过程中N基因的正负链RNA的拷贝数进行了定量检测。结果表明，以重组质粒标准品构建的标准曲线在10~2拷贝/μL～10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系，对正负链的检测下限为10拷贝/μL，能够特异性的区分病毒复制过程中产生的正负链，具有较高的特异性、灵敏性和重复性。SADS-CoV感染IPI-2I细胞后，其病毒正负链含量水平呈现持续增加。以MOI=1感染细胞48h后，其病毒正负链拷贝数可分别达到1.8×10~8拷贝/μL和5.6×10~4拷贝/μL。本研究成功建立了SADS-CoV N基因链特异性SYBR Green实时荧光定量检测法，可区分和定量SADS-CoV在复制过程中产生的不同链RNA，为后续病毒的复制转录调控机理和相关抗病毒机制的研究提供了有效检测手段。
关键词：猪急性腹泻综合征冠状病毒;链特异性检测;实时荧光定量PCR
基金资助：广东省基金（项目号：2022A1515012473）,题目：LncRNA8244-miR-320-CCR7轴在SVA感染PK-15细胞中调控IFN-β表达的分子机制~~
