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作者：张燕迪;顾涛涛;任红艳;毕延震;方桂杰;
单位：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室;湖北工业大学生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室;
摘要：本文旨在研究猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA在猪睾丸支持细胞（ST）中的干扰作用。利用PCR法从ST细胞基因组中扩增猪睾丸ACE启动子，构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic，通过红色荧光蛋白表达和双荧光素酶报告基因检测试验检测猪睾丸ACE启动子在ST细胞中的转录活性；根据SPAG6 mRNA靶序列设计合成3条siRNA序列，通过脂质体转染至ST细胞，利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA的干扰效率；基于人miR-30a结构设计SPAG6 shRNA，构建重组载体ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,Western Blot检测其对SPAG6的干扰效果。结果表明，成功构建重组质粒ACEpIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic，并证明猪睾丸ACE启动子在ST细胞中具有较强的转录活性；各试验组均能对靶基因SPAG6 mRNA的表达产生抑制作用，以siRNA-3的作用最佳。siRNA-3转染48 h后，SPAG6蛋白表达量显著下降（P<0.001），成功筛选出SPAG6基因的最佳干扰序列；成功构建重组质粒ACE-shSPAG6-pcDNA3.1，转染ST细胞48h后SPAG6蛋白表达量较阴性对照组显著下调（P<0.001）。本研究成功构建了猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体，并在ST细胞中验证了其具有较好的干扰效果。
关键词：SPAG6;ACE;siRNA;shRNA;基因表达
基金资助：农业关键核心技术攻关项目（NK2022010207）; 湖南省重点领域研发计划（2020WK2030）; 中国科学院战略性先导科技专项（XDA24030204）; 湖北省农业科技创新中心项目（2022-620-000-001-20）; 湖北省农业科学院领军人才项目（L2018015）
