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作者：姜宇朗;余永鑫;潘子扬;孙明瑜;
单位：上海中医药大学附属曙光医院;上海中医药大学肝病研究所肝肾疾病病证教育部重点实验室;上海中医药大学;
摘要：目的 研究6-姜辣素能否增强RSL3诱导的肝癌细胞铁死亡效应及其具体作用机制。方法 选取人肝癌细胞株HepG2,根据6-姜辣素对于正常肝细胞L02的最大无毒浓度和RSL3对HepG2细胞的半数抑制浓度(IC_(50))来确定6-姜辣素和RSL3的终浓度。细胞按不同处理因素分为3组，分别是空白对照组，RSL3处理组(2μmol/L),RSL3(2μmol/L)+6-姜辣素(50μmol/L)处理组。用CCK8法检测细胞活力，平板克隆形成实验评价细胞长期增殖能力，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放实验检测胞内LDH毒性。流式细胞术检测细胞内脂质过氧化物水平。倒置荧光显微镜观察细胞内活性氧含量(reactive oxygen species, ROS)和线粒体膜电位水平。不同程序性死亡细胞抑制剂观察6-姜辣素联合RSL3诱导的肝癌细胞的程序性死亡方式，并检测胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平变化。Western Blot法检测铁死亡相关蛋白：谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、铁蛋白重链(ferritin heavy chain, FTH1)、前列腺素内过氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2)表达水平。网络药理学分析其可能的直接作用靶点。结果 6-姜辣素可以显著增强RSL3抑制肝癌细胞增殖和克隆形成的能力(P<0.001),这种细胞死亡方式可以不同程度地被特异性铁死亡抑制剂Fer-1、Lip-1、DFO抑制(P<0.001)。同时6-姜辣素联合RSL3可以显著增强细胞内脂质过氧化物、MDA、ROS的水平(P<0.001),同时可以显著降低GSH含量和线粒体膜电位，显著降低铁死亡抑制基因GPX4、FTH1、SLC7A11的蛋白表达水平(P<0.05),提高了PTGS2蛋白的表达水平(P<0.01)。网络药理学结果显示PTGS2可能是6-姜辣素联合RSL3治疗肝癌的作用靶点之一。结论 6-姜辣素联合RSL3通过上调PTGS2增加了肝癌细胞铁死亡的敏感性。
关键词：6-姜辣素;;RSL3;;PTGS2;;铁死亡;;肝癌
基金资助：山东省重点研发计划项目(2021CXGC010509);; 国家中医药管理局中医肝胆病重点学科、国家中医药管理局慢性肝病虚证重点实验室、上海市中医临床医学重点实验室项目(20DZ2272200);; 国家中医学药管理局高水平中医药重点学科建设项目(中医肝胆病学)(zyyzdxk-2023060)
