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作者：刘佳琪;李梦瑶;郝晨琳;曾权;许梦潇;丁雪燕;靳晓慧;胡慧;张红垒;
单位：河南农业大学动物医学院;河南省动物性食品病原体监控重点实验室;
摘要：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建受体相互作用蛋白激酶1(Receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)基因缺失的小鼠神经母细胞瘤细胞（Neuro-2a），并探究敲除RIPK1基因后对乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）复制及对JEV诱导的细胞死亡的影响。根据NCBI数据库中小鼠的RIPK1基因序列（Gene ID:19766）设计三条sgRNA，构建LentiCRISPR v2-RIPK1重组敲除质粒，并将其转染至HEK-293T细胞中获得慢病毒液；使用嘌呤霉素对慢病毒液感染的Neuro-2a细胞进行筛选，再通过有限稀释法获取RIPK1敲除的Neuro-2a单克隆细胞，对其进行基因组测序和Western blot试验鉴定。测序结果显示RIPK1基因发生了26 bp碱基缺失并且Western blot试验未检测到RIPK1蛋白的表达。利用CCK-8评估RIPK1基因敲除后细胞活力的变化，结果显示RIPK1敲除后不影响Neuro-2a的细胞活力。使用Western blot和Annexin V-mCherry/SYTOX Green染色试验检测RIPK1基因敲除对JEV复制及JEV诱发的细胞死亡的影响，与野生型细胞相比，RIPK1敲除后并未对JEV复制产生影响，但减少了JEV诱发的细胞死亡。本试验利用CRISPR/Cas9技术成功构建了RIPK1基因缺失的Neuro-2a细胞，为进一步探究RIPK1在JEV引发的细胞死亡中的分子机制提供细胞模型。
关键词：RIPK1基因;;CRISPR/Cas9基因编辑技术;;Neuro-2a细胞;;乙型脑炎病毒
基金资助：国家自然科学基金青年科学基金：（项目号：32002297）,题目：乙型脑炎病毒NS1蛋白抑制TLR3受体介导Ⅰ型干扰素产生的分子机制;; 河南省高校科技创新人才支持计划：（项目号：24HASTIT057）,题目：预防兽医学~~
