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作者：郭怡莹;王雪容;杨王浩;曹梦丹;张海森;靳亚平;陈华涛;
单位：西北农林科技大学动物医学院;农业农村部动物生物技术重点实验室;
摘要：本研究旨在构建并筛选干扰效率高的奶牛NR1D1基因慢病毒干扰载体，以探究生物钟核受体NR1D1在大肠杆菌脂多糖（LPS）诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞（BEND）炎性反应中的作用。使用1μg/mL LPS处理BEND 12 h建立炎性反应模型，qPCR检测炎症因子与生物钟基因的表达变化；设计2对靶向奶牛NR1D1基因的特异性短发夹RNA(shRNA)序列和1对无义序列，退火后分别连接至pCD513B-U6载体构建3个重组质粒，随后进行酶切和测序鉴定。将酶切测序鉴定均无误的重组质粒与辅助质粒共转染至HEK293T细胞包装慢病毒，获得病毒颗粒后用其感染BEND,2μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系并使用qPCR和WB鉴定干扰效率。LPS处理NR1D1敲低组与对照组BEND细胞，采用qPCR技术检测炎症因子IL-6、IL-8、IL-1βmRNA的表达变化。结果表明：LPS处理BEND后，IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子显著升高，表明BEND炎性反应模型构建成功。同时，LPS处理后，生物钟核受体NR1D1 mRNA表达量显著升高，提示其可能参与BEND炎性反应的调控；成功构建2个NR1D1基因慢病毒干扰载体sh1和sh2,WB结果显示，sh1和sh2均能有效降低NR1D1的表达，其中sh2的干扰效果最好，使用嘌呤霉素筛选成功获得sh2的敲低细胞系；LPS处理后，炎症因子在sh2细胞系中的表达显著高于shn组。本研究成功构建了奶牛NR1D1基因的慢病毒干扰载体，通过转染BEND细胞，筛选并成功获得了NR1D1敲低的稳定细胞系，发现NR1D1在LPS诱导的BEND炎性反应中可能发挥抑制促炎因子表达的作用，为后续深入探究NR1D1在奶牛子宫内膜炎发生发展过程中的作用机制提供前期基础。
关键词：奶牛;NR1D1基因;子宫内膜炎;慢病毒;RNA干扰
基金资助：国家自然科学基金面上项目（32373088）; 西北农林科技大学大学生创新创业训练项目（X202310712177）
