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作者：蔡建涛;张伟;陈治彤;刘泓屹;吕岳芹;曹伟军;冷非凡;杨帆;郑海学;
单位：兰州理工大学生命科学与工程学院;中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室;甘肃省病原生物学基础学科研究中心;
摘要：本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建RAB20基因敲除的PK-15细胞系，为RAB20蛋白功能研究提供生物材料，同时初步探究RAB20蛋白对口蹄疫病毒（FMDV ）增殖的影响。首先，根据RAB20基因序列设计合成2对sgRNA，分别构建于载体质粒pX459中，将重组质粒转染PK-15细胞，用嘌呤霉素筛选，并经有限稀释法进行亚克隆。接着，对单克隆细胞测序及Western-blot以鉴定RAB20基因的敲除，并利用CCK-8测定RAB20敲除对细胞活力的影响。然后，用FMDV感染RAB20敲除细胞和野生型细胞，利用Western-blot、实时荧光定量PCR、间接免疫荧光试验和病毒滴度测定等方法比较FMDV在敲除细胞系与野生型细胞中的复制差异。结果显示：成功构建了RAB20基因敲除的PK-15细胞系，且与野生型细胞相比，FMDV在RAB20敲除细胞中的复制水平显著提升，表明RAB20对FMDV的复制具有抑制作用。该结果为进一步研究RAB20功能及其调控病毒复制的机制提供了细胞模型与数据支持。
关键词：CRISPR/Cas9;;RAB20基因;;细胞系;;口蹄疫病毒
基金资助：国家自然科学基金项目(32072831,32102639);; 国家重点研发计划项目(2021YFD1800300);; 甘肃省杰出青年基金项目(21JR7RA026);; 兰州大学中央高校基本科研业务费专项(lzujbky-2022-ey20);; 甘肃省科技重大专项(22ZD6NA001)
