细胞免疫研究论文2篇
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篇(1)
〔摘要〕 目的 研究婦科千金胶囊对小鼠脾淋巴细胞体外增殖及免疫调节的影响。方法 分离制备小鼠脾淋巴细胞，将细胞分为空白组(不做任何处理)，刀豆蛋白A组(刀豆蛋白A干预，ConA组)，LPS组(脂多糖干预，LPS组)及不同浓度的妇科千金胶囊组(FKQ)，作用时间分别为24 h、48 h和72 h。CCK8法检测FKQ对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响;MTT法检测ConA及LPS对脾淋巴细胞增殖的影响;流式细胞术检测各组小鼠脾淋巴细胞中CD4+和CD8+的比例并计算CD4+/CD8+的比值;ELISA检测各组细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表达。结果 FKQ对小鼠脾淋巴细胞有显著的增殖作用，以浓度为30、40、50 μg/mL时其作用越明显(P<0.01);FKQ能对ConA诱导的T淋巴细胞及LPS诱导的B淋巴细胞增殖有着明显的促进作用，以浓度为50 μg/mL最显著(P<0.01);中、高浓度的FKQ协同ConA能升高CD4+的比例，降低CD8+的比例，显著升高CD4+/CD8+的比值(P<0.01)。此外，不同浓度的FKQ均能明显增加IFN-γ及IL-2的表达(P<0.01，P<0.05)，降低IL-4和IL-10的水平，以中、高浓度最为显著(P<0.01)，调节Th1/Th2平衡。结论 妇科千金胶囊可有效促进脾淋巴细胞增殖，升高CD4+和CD8+比例，促进Th1细胞因子的分泌，使Th1/Th2亚群向“Th1漂移”，调节Th1/Th2平衡，提高细胞免疫应答。
〔关键词〕 妇科千金胶囊;脾淋巴细胞;增殖;免疫调节;Th1/Th2
妇科千金胶囊(FKQ)是中国中药保护品种，收载于2015版《中华人民共和国药典》一部，由千斤拔、金樱根、穿心莲、单面针、功劳木、鸡血藤、当归、党参8味中药材组成，具有清热除湿、益气化瘀的功效。常用于湿热瘀阻所致的带下病、腹痛，症见带下量多、色黄质稠、臭秽、小腹疼痛、腰骶酸痛、神疲乏力等，既标本兼治，又扶正祛邪，临床上广泛用于妇科炎症，疗效甚佳。方中千斤拔祛风利湿解毒，金樱根清热利湿止带，二者同为君药;穿心莲和功劳木清热除湿，二者同为苦寒之品，合用使全方清热解毒之力增强;单面针以其辛温之性，可防穿心莲、功劳木过于苦寒而傷胃，使全方药性更趋平和，无伤正气之虞，三者共为臣药。当归补血活血、调经止痛，鸡血藤补血、活血、通络，二者合用既能补血调经，又能畅利血行而加强全方清热除湿、活血解毒之功能;党参补中益气、生津养血，与当归、鸡血藤合用气血双补、扶正固本，使全方融扶正、祛邪为一体，三者共为佐药。诸药合用使机体正气得以充养，邪气得以祛除，故诸症消除。
中医学十分重视人体的正气，强调正气是发病的主导，认为“正气存内，邪不可干;邪之所凑，其气必虚”。意指当人的正气在内，气血充足的时候，即机体免疫力正常，“外邪”即致病菌不容易侵犯机体致病;而当人体正气受损，即免疫功能低下时，致病菌容易乘虚而入发病。FKQ的治疗理念在清除致病菌的同时增强机体免疫力，后期通过强化自身免疫能力而防治疾病反复发作。脾脏作为机体最大的外周免疫器官，是T、B淋巴细胞的主要聚集场所，而T、B淋巴细胞作为机体免疫活性细胞，其激活、分化、增殖在免疫应答过程中起着重要的作用[1]。关于FKQ能调节由环磷酰胺引起的小鼠免疫功能障碍及FKQ组分中药对机体免疫调节研究较多[2-5]，但尚无FKQ对体外培养小鼠脾淋巴细胞的免疫增强活性的报道。因此，本实验以FKQ为研究对象，研究其对小鼠脾淋巴细胞的增殖及免疫调节的影响，以期为FKQ提高免疫作用机制的研究及开发利用奠定理论依据。
1 材料
1.1 实验动物
20只健康BALB/c雌性小鼠，体质量16～18 g，6～7周龄，由湖南斯莱克景达实验动物公司提供，许可证号：SCXK(湘)2019-0004。实验动物饲养于湖南中医药大学实验动物中心，自由饮食饮水，实验程序由湖南中医药大学动物实验伦理委员会批准。
1.2 药品与试剂
妇科千金胶囊(FKQ)(产品批号20170231，株洲千金药业股份有限公司);CCK8(CA1210，北京索莱宝科技有限公司);胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(16000-044，美国gibco公司);1640培养基(C11875500BT，美国gibco公司);DMEM高糖培养基(SH30022.01，Hyclone公司);ConA刀豆蛋白、LPS脂多糖及MTT噻唑兰(批号分别为C8110、L8880、M8180，北京索莱宝科技有限公司);Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10 ELISA Kit(批号为PI508、PI575、PI612、PI522，上海碧云天生物技术有限公司)。
1.3 仪器
47103离心机(Eppendorf中国有限公司);SW-CJ-2FD苏州净化超净工作台(上海叶拓科技有限公司)、Blender 快速组织细胞破碎仪(美国 NextAdvance 公司)、Cyto-Flex 流式细胞仪(美国Beckman公司)。
2 方法
2.1 小鼠脾脏细胞的分离
将小鼠腹腔麻醉后，颈椎脱臼处死，75%酒精将小鼠浸泡15 min;在超净台中取出小鼠脾脏，去除筋膜后反复用PBS冲洗至无血色;将脾脏置于200目细胞筛上，注射器研磨，用PBS冲洗6次后置于培养皿中;收集细胞悬液，1 500 r/min离心10 min，弃上清;加入10%红细胞裂解液适量，室温静置10 min，1 500 r/min离心10 min，弃上清;PBS清洗3遍，1 500 r/min离心10 min，弃上清;加入0.85%NaCl溶液重悬沉淀;密度梯度离心加样，1 800～2 000 r/min离心40 min;收集目标分层，PBS清洗3遍;RPMI-1640完全培养基重悬细胞沉淀，调节细胞浓度为1×108，转入培养瓶中37 ℃、5%CO2孵育3 h，去除贴壁细胞，收集悬浮细胞进行后续实验。
2.2 CCK8法检测FKQ对脾淋巴细胞的增殖作用
将FKQ设置成10、20、30、40、50 μg/mL，不同药物浓度孵育小鼠脾淋巴细胞24 h、48 h和72 h。将处理完成的细胞制备细胞悬液，将1×104的细胞数接种到96孔板中，每孔约100 μL细胞悬液，每个浓度设3个复孔，培养12 h使其贴壁。每孔加入10 μLCCK8继续培养1 h后，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，吸光度值与细胞的增殖能力成正比。
2.3 MTT法检测FKQ对ConA诱导脾淋巴细胞增殖的影响
细胞分离、接种方法同前，参考文献[6]，本实验分为空白组，模型组(ConA，5 μg/mL)，FKQ组：不同浓度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分别干预ConA诱导脾淋巴细胞。于37 ℃，5%CO2培养箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法检测FKQ对ConA诱导脾淋巴细胞增殖功能，测定方法同CCK8法。
2.4 MTT法检测FKQ对LPS诱导的脾淋巴细胞增殖的影响
细胞分离、接种方法同前，参考文献[7]，本实验分为空白组，LPS组(LPS，10 μg/mL)，FKQ组：不同浓度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分别干预LPS诱导的脾淋巴细胞。于37 ℃，5%CO2培养箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法检测LPS诱导脾淋巴细胞增殖功能。
2.5 流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4+和CD8+亚群的变化
将脾淋巴细胞(1×108)加入24孔板，设空白组、ConA组(ConA，5 μg/mL)和FKQ组：不同浓度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分别干预ConA诱导脾淋巴细胞。每组均有3个复孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，孵育48 h，离心收集细胞，磷酸盐缓冲溶液清洗，然后使用小鼠单克隆抗体CD4+-FITC或者CD8+-FITC孵育后磷酸鹽缓冲溶液清洗，流式检测CD4+和CD8+的百分比。
2.6 ELISA法检测细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量
将脾淋巴细胞(1×108)加入96孔板，设空白组(不做任何刺激)、ConA组(ConA刺激)、LPS组(LPS刺激)和FKQ组：不同浓度的FKQ(10、30和50 μg/mL)分别干预ConA诱导脾T淋巴细胞和LPS诱导脾B淋巴细胞，每组均有3个复孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，孵育48 h，收集细胞上清，2 000 r/min室温离心5 min，取上清，按说明书操作，经酶标仪测定OD值。
2.7 统计学处理
使用SPSS 22.0统计学软件整理数据，计量资料以“x±s”表示，当数据符合正态分布时，多组间比较使用单因素方差齐性分析(One-way ANOVA)，当P<0.05时差异有统计学意义。
3 结果
3.1 FKQ对脾淋巴细胞的增殖作用
对小鼠脾淋巴细胞分别孵育24 h、48 h和72 h后，结果发现，当细胞孵育24 h，浓度为10、20 μg/mL的FKQ对小鼠脾淋巴细胞增殖无差异(P>0.05);浓度在30、40、50 μg/mL时对细胞增殖有着显著的促进作用(P<0.01)。当孵育细胞48 h，与浓度为10 μg/mL的FKQ相比，浓度在20、30、40、50 μg/mL时能明显增加脾淋巴细胞增殖(P<0.01)，且随着剂量的增加其增殖作用越明显。细胞孵育72 h后，30 μg/mL的FKQ对细胞增殖有促进作用(P<0.05);40、50 μg/mL的FKQ对细胞增殖促进作用更为明显(P<0.01)。其他浓度组的细胞存活率无显著性差异，说明各浓度组药物对细胞无明显毒性。与培养24 h相比，FKQ浓度为10、30、50 μg/mL时，培养48 h与72 h，对小鼠脾淋巴细胞增殖无影响(P>0.05);FKQ浓度为20、40 μg/mL时，培养48 h时能明显促进细胞增殖(P<0.01)。见表1。
3.2 FKQ对ConA诱导脾T淋巴细胞增殖的影响
由表2可知，与ConA组相比，10～50 μg/mL的FKQ对T淋巴细胞的增殖具有显著性差异(P<0.01)，有显著的量效关系，但只在24 h时剂量依赖性最明显;细胞孵育48 h及72 h时，FKQ浓度在10 μg/mL和30 μg/mL时对细胞增殖作用差异较小，而当其浓度达到50 μg/mL时，其差异变化较大。
3.3 FKQ对LPS诱导脾B淋巴细胞增殖的影响
由表3可知，LPS在不同的孵育时间对B淋巴细胞都有明显增殖促进作用;10～50 μg/mL的FKQ对B淋巴细胞的增殖存在明显差异(P<0.05，P<0.01)，在细胞孵育24 h及72 h时剂量依赖性最明显;当细胞孵育24 h及72 h时，FKQ浓度在10 μg/mL和30 μg/mL时对细胞增殖作用差异较小，而当其浓度达到50 μg/mL时，其差异变化较大。当细胞孵育48 h时，FKQ浓度在10 μg/mL和30 μg/mL时对细胞增殖作用差异最大，浓度在50 μg/mL时，其差异最小。
3.4 FKQ对小鼠脾淋巴细胞中CD4+和CD8+亚群的影响
如图1所示，与对照组相比，在ConA的刺激下，CD4+ T细胞比例显著升高(P<0.01)，而随着FKQ的浓度升高CD4+ T细胞的比例出现增加的趋势，但低浓度FKQ与ConA协同效果不明显，而当FKQ达到中、高浓度时开始与ConA产生协同作用(P<0.01);经ConA刺激后CD8+ T细胞比例降低;中、高浓度FKQ协同ConA能显著升高CD4+/CD8+比值，调节机体免疫功能(P<0.01)。说明中、高浓度的FKQ与ConA能产生协同作用，调节机体免疫平衡。
3.5 FKQ对小鼠脾淋巴细胞INF-γ、IL-2、IL-4及IL-10表达的影响
表4结果显示，与空白组相比，单用ConA和LPS刺激均能显著增加IFN-γ、IL-2的含量，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05);与单用ConA及LPS刺激相比，ConA协同50 μg/mL FKQ能促进IL-2的表达，LPS协同不同浓度的FKQ对IFN-γ、IL-2的表达均有显著促进作用(P<0.01)，同时结果发现，与空白组相比，ConA及LPS的刺激显著降低了细胞中IL-4的表达(P<0.01，P<0.05)，而增加IL-10的表达(P<0.01)。与单用ConA及LPS刺激相比，FKQ协同ConA、LPS刺激均能降低IL-4、IL-10的表达，尤以中、高浓度最为显著(P<0.01)。
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篇(2)
摘要：为探讨分离自患病刺参(Apostichopus japonicus)的一株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染刺参后，刺参体腔细胞免疫相关基因的响应变化，分别给刺参注射100 μL生理盐水(对照组)和1×109 CFU/mL溶藻弧菌菌液(实验组)，用荧光定量PCR技术，检测24 h内刺参体腔细胞Lys、Rel和p105基因表达的变化。结果表明，注射生理盐水对刺参体腔细胞Lys、Rel和p105基因表达量无显著影响。感染溶藻弧菌后，实验组刺参体腔细胞中溶菌酶基因的表达量在24 h显著升高，且1 h和24 h时的表达量显著高于对照组(P<0.05);刺参体腔细胞中p105基因在感染后表达量呈上升趋势，3 h达到峰值，在3 h和6 h，p105基因的表达量显著高于对照组(P<0.05);刺参体腔细胞Rel基因表达量在感染后无显著变化。可见刺参感染溶藻弧菌后其体腔细胞Lys和p105基因的表达在短时间内迅速响应。
关键词：刺参(Apostichopus japonicus);溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus);体腔细胞;基因表达
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)属于弧菌科，弧菌属，革兰氏阴性菌，是一种常见的海洋致病菌，对鱼、虾、贝等海水养殖动物都有较强的致病性[1-4]。溶藻弧菌会在侵袭和增殖过程中对机体造成细胞和组织损伤以及其代谢产物干扰和破坏机体的局部或全身的正常新陈代谢或机能[3-5]。卢芷程等[5]的研究结果表明溶藻弧菌感染凡纳滨对虾后会启动其免疫机制并产生活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)以对抗病原菌入侵，随感染时间的延长抗氧化系统会被激活。李晶晶等[6]在研究中也表明凡纳滨对虾感染溶藻弧菌后，需要不断保持较高的免疫水平，其体内的3种Toll样受体(Toll-like receptors)基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高。溶藻弧菌也是刺参病害的主要致病菌之一[7]，但关于其对刺参免疫的研究较少。刺参体腔细胞在刺参非特异性免疫中起着非常重要的作用，是其最基本的防御武器[8]。溶菌酶是刺参体腔细胞重要的免疫抗菌蛋白，其活性是表征机体对细菌性病原抵抗能力的重要指标[9]。核因子κB(NF-κB)信号通路是先天性免疫中最为重要的途径，Rel、p105是该信号通路上重要的转录因子，同时Rel、p105基因已在刺参上被成功克隆到序列[10]。因此本研究聚焦刺参体腔细胞的非特异性免疫，选取刺参体腔细胞溶菌酶(Lys)、Rel、p105基因为目标基因，探讨刺参体腔细胞对溶藻弧菌(从患病刺参体壁分离)刺激后24 h内Lys、Rel、p105免疫基因的响应，为进一步探究刺参抵抗溶藻弧菌感染的免疫机理提供基础参考。
1材料与方法
1.1实验动物
实验所用刺参购买于东方海洋生物科技有限公司。选取平均体重为3 g的健康刺参200头，暂养于连续充气的水箱中，常规养殖管理，暂养1周。实验开始前将刺参分为实验组与对照组。
1.2实验菌株
实验菌株分离自患病刺参，经16S rDNA鉴定为溶藻弧菌。使用2216E培养基，28 ℃对其进行液体培养，培养过夜后，离心(6 000 r/min，10 min，4 ℃)收集菌体，菌体用0.85%的生理盐水重悬，将细菌浓度调节至1×109 CFU/mL备用。
1.3溶藻弧菌的急性感染与样品采集
注射实验开始前，取18头刺参，每6头刺参的体腔细胞混在一起，作为一个重复，即为0时刻的样本。对照组每头刺参体壁注射0.1 mL生理盐水，多点注射。实验组每头刺参体壁注射0.1 mL浓度为1×109 CFU/mL的溶藻弧菌菌液，多点注射。注射后分别在1、3、6、12、24 h取样，每个时刻随机取18头刺参，解剖刺参获取刺参的体腔液，每6头刺参的体腔液混合在一起作为一个重复样本，每一时刻三个重复。体腔液转入离心管中，4 000 r/min，4 ℃离心，去上清，每管体腔细胞加入1 mL TransZolTM Up(北京全式金)，并用枪反复吹吸，使体腔细胞裂解，液氮速冻，转入-80 ℃冰箱保存，用于体腔细胞RNA的提取。
1.4免疫相关基因表达量的测定
1.4.1刺参体腔细胞RNA的提取取-80 ℃保存的刺参体腔细胞，按照TransZolTM Up Plus RNA Kit (北京全式金)试剂盒说明提取RNA。用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否被降解;用微量紫外分光光度计检测RNA的浓度。RNA-80 ℃保存备用。
1.4.2cDNA的合成和荧光定量PCR使用TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix (北京全式金)试剂盒对刺参体腔细胞RNA进行反转录。向无RNAase的PCR管中依次加入500 ng模板RNA、4 μL 5×TransScript All-in-One SuperMix for qPCR、1 μL gDNA Remover，補足RNase-free Water 至20 μL。轻轻混匀，42 ℃孵育15 min。85 ℃加热5 s。得到的cDNA -20 ℃ 保存备用。
引物设计参考Wang等[10]、Yang 等[11]，由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。按照TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix (北京全式金)试剂盒操作说明，进行荧光定量PCR。扩增反应体系如下：Template 1 μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 04 μL、2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、dd H2O 8.2 μL。PCR 程序为： 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 10 s;56 ℃ 25 s;72 ℃ 25 s，共40个循环。以Cytb为内参基因，基因的相对表达量以 2-ΔΔ CT法进行计算[12]。
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