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作者：姚晓含;姚明辰;王志清;李赫阳;闫燕;雷宁静;
单位：郑州大学第一附属医院医学研究中心;郑州大学第一临床医学院;郑州大学基础医学院微生物与免疫学系;
摘要：目的：探讨沉默G蛋白偶联受体139(GPR139)基因对乳腺癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响，并阐明其可能的作用机制。方法：通过癌症基因组图谱（TCGA）和人类蛋白质图谱（HPA）数据库下载GPR139 mRNA和蛋白在乳腺癌组织与正常组织中的表达情况。利用慢病毒干扰技术将GPR139短发夹RNA(shRNA)转染至人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞系中，分为sh-NC组（感染阴性对照慢病毒）、sh-GPR139（感染GPR139 shRNA干扰慢病毒）和sh-NC+F05组（感染阴性对照慢病毒后，加入GPR139拮抗剂NCRW0005-F05）。采用噻唑蓝（MTT）法检测各组乳腺癌细胞增殖活性，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组乳腺癌细胞中细胞增殖标志物Ki-67、细胞周期素（Cyclin） D1、Cyclin E1和P21 mRNA及蛋白表达水平，流式细胞术检测各组乳腺癌细胞凋亡率，Western blotting法检测各组乳腺癌细胞中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK、Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)、磷酸化ULK1、微管相关蛋白1轻链3A/B(LC3A/B)和P62蛋白表达水平，免疫荧光法检测各组乳腺癌细胞中LC3A/B蛋白表达水平。结果：TCGA和HPA数据库，在人乳腺癌组织中的GPR139 mRNA表达水平明显高于正常组织（P<0.001）,GPR139蛋白表达量明显高于正常组织。MTT法，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组乳腺癌细胞增殖活性明显降低（P<0.01）。Western blotting法，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组乳腺癌细胞中GPR139、Ki67、Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）,P21蛋白表达水平升高（P<0.01）。RT-qPCR法，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组乳腺癌细胞中GPR139 、 Ki67 、 Cyclin D1和Cyclin E1 mRNA表达水平降低（P<0.05或P<0.01）,P21 mRNA表达水平升高（P<0.01）。流式细胞术，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组乳腺癌细胞凋亡率明显增加（P<0.01）。免疫荧光法，在MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组细胞中LC3A/B蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。Western blotting法，与sh-NC组比较，sh-GPR139组和sh-NC+F05组LC3A/B、p-AMPK和p-ULK1蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,P62蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。结论：沉默GPR139基因可诱导乳腺癌细胞自噬和凋亡，抑制细胞增殖，其机制可能与升高细胞中AMPK和ULK1磷酸化水平有关。
关键词：乳腺癌;;G蛋白偶联受体139;;细胞增殖;;细胞凋亡;;自噬;;腺苷酸活化蛋白激酶
基金资助：国家自然科学基金青年科学基金项目（82303343）
