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作者：黄立敏;张春丽;孙晋;任松;田红卫;
单位：西安交通大学第二附属医院生物诊断治疗国家地方联合工程中心;西安交通大学第二附属医院普通外科四病区;
摘要：目的：通过在线网站和软件预测人源RNA解旋酶DHX37基因的功能结构域，构建其不同功能结构域缺失载体，并验证构建载体的正确性。方法：以人源DEAH-box解旋酶37(hDHX37)质粒作为模板，基于同源重组克隆技术，应用SnapGene V 6.0. 2软件设计截短体ATP结合结构域（ΔATP binding）、C末端结构域（CTD）、HA2亚基（HA2）和Oligos/Accharide结合折叠域（O/A binding fold）的功能结构域特异性引物；采用高保真DNA聚合酶Prime STAR GXL polymerase进行PCR扩增截短体目的片段ATP binding、 c-terminal-1、 c-terminal-2、 HA2-1、 HA2-2和O/A binding fold；利用重组克隆试剂盒将截短体片段定向克隆至经双酶切的pCMV-MCS-3×HA-Neo空载体；将重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，通过限制性内切酶HindⅢ酶切、琼脂糖凝胶电泳和DNA测序验证功能结构域载体的正确性。结果：PCR法扩增的目的片段ATP binding(2 148 bp)、c-terminal-1(1 326 bp)、c-terminal-2(1 269 bp)、HA2-1(2 205 bp)、HA2-2(894 bp)和O/A binding(2 583 bp)长度与设计一致；HindⅢ单酶切突变质粒ΔATP binding、Δc-terminal、ΔHA2和ΔO/A binding fold，得到线性化DNA片段，长度分别为8 939、7 589、8 036、8 540和8 027 bp，产物条带大小均与设计相符。DNA测序Blast对比分析，ΔATP binding缺失ATP binding结构域（1～442）、Δc-terminal缺失c-terminal结构域（443～735）、ΔHA2缺失HA2结构域（736～861）和ΔO/A binding fold缺失O/A binding fold结构域（862～1 158），分别缺失1 326、879、375和891 bp，各突变质粒缺失的结构域位置和长度与设计完全一致。结论：成功构建hDHX37基因的ΔATP binding、Δc-terminal、ΔHA2和ΔO/A binding fold 4个不同功能结构域载体。
关键词：DEAH-box解旋酶37;;功能结构域载体;;重组克隆;;限制性酶切;;聚合酶链式反应
基金资助：国家自然科学基金项目（81802456）;; 陕西省科技厅自然科学基金面上项目（2024JC-YBMS-691）
