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作者：葛睿涵;李晨;王生鹏;卢洋;谭彩霞;崔皓天;王新敏;章乐;
单位：石河子大学医学院病理生理学教研室;新疆地方与民族高发病教育部重点实验室;石河子大学第一附属医院泌尿外科;国家卫健委中亚高发病防治重点实验室;
摘要：目的:探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)-髓系细胞白血病序列1 (Mcl-1)信号轴在卡介苗(BCG)感染巨噬细胞极化进程中的作用,并阐明其可能的分子机制。方法:从高通量基因表达(GEO)数据库下载GSE89391和GSE51029转录组测序数据,从分子特征数据库(MSigDB)下载MAPK信号通路相关基因集。采用基因集变异分析(GSVA)包对GEO数据库中巨噬细胞数据进行单样本基因集富集分析(ssGSEA),计算MAPK信号通路活性评分。根据Mcl-1表达水平中位数将感染样本分为Mcl-1高表达组和Mcl-1低表达组,并进行基因集富集分析(GSEA)。采用Spearman相关分析法评估GEO数据库中巨噬细胞中Mcl-1表达水平与MAPK通路活性的相关性。配制细胞外信号调节激酶(ERK)通路阻断剂PD98059 (50μmol·L~(-1))、c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路阻断剂SP600125(30μmol·L~(-1))和p38通路阻断剂SB203580 (60μmol·L~(-1))。将Raw264.7细胞分为对照组、各阻断剂处理组、BCG组及BCG感染后各阻断剂处理组,制备BCG菌液并感染相应组细胞,各组加入相应阻断剂。0、12和24 h后收集各组细胞上清及细胞样本。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组巨噬细胞上清中Mcl-1、白细胞介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素10 (IL-10)及转化生长因子β (TGF-β)水平,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组巨噬细胞中M1型标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA和M2型标志物炎症区域分子1(Fizz1) mRNA表达水平。结果:GEO数据库,与未被结核分枝杆菌(MTB)感染的对照巨噬细胞比较,MTB感染的巨噬细胞中Mcl-1基因表达水平明显升高(P<0.05)。ssGSEA分析,与未被MTB感染的对照巨噬细胞比较,MTB感染的巨噬细胞中MAPK信号通路活性评分明显升高(P<0.05)。GSEA分析,Mcl-1高表达组差异表达基因显著富集于MAPK通路(P<0.05)。Spearman相关性分析,Mcl-1基因表达水平与MAPK信号通路活性评分呈正相关关系(P<0.05)。干预12和24 h后,与BCG组比较,阻断剂处理的各组巨噬细胞上清液中Mcl-1水平明显降低(P<0.05)。干预12 h后,与对照组比较,BCG组巨噬细胞上清液中IL-6和TNF-α水平均明显升高(P<0.05);与BCG组比较,BCG+SP组和BCG+PD+SP组巨噬细胞上清液中IL-6及TNF-α水平均明显降低(P<0.05)。干预24 h后,与对照组比较,BCG组巨噬细胞上清液中TNF-α水平明显升高(P<0.05);与BCG组比较,BCG+PD组、BCG+SP组、BCG+SB组和BCG+PD+SP组巨噬细胞上清液中IL-6水平均明显降低(P<0.05),加入阻断剂的各组巨噬细胞上清液中TNF-α水平均明显降低(P<0.05)。干预12 h后,与对照组比较,BCG组巨噬细胞上清液中TGF-β水平明显升高(P<0.05);与BCG组比较,BCG+SP组、BCG+PD+SP组、BCG+PD+SB组、BCG+SP+SB组和BCG+PD+SP+SB组巨噬细胞上清液中TGF-β水平均明显升高(P<0.05)。干预24 h后,与对照组比较,BCG组巨噬细胞上清液中IL-10水平明显升高(P<0.05);与BCG组比较,BCG+PD组、BCG+SP组、BCG+PD+SP组、BCG+PD+SB组和BCG+SP+SB组巨噬细胞上清液中IL-10及TGF-β水平均明显降低(P<0.05)。感染后0h,与对照组比较,BCG组巨噬细胞中iNOS和Fizz1 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05)。干预12h后,与对照组比较,BCG组巨噬细胞中iNOS mRNA表达水平明显降低(P<0.01),Fizz1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);与BCG组比较,加入阻断剂后各组巨噬细胞中iNOS mRNA表达水平均明显升高(P<0.01),BCG+PD组、BCG+PD+SP组、BCG+PD+SB组、BCG+SP+SB组和BCG+PD+SP+SB组巨噬细胞中Fizz1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。干预24 h后,与对照组比较,BCG组巨噬细胞中iNOS和Fizz1 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05);与BCG组比较,加入阻断剂的各组巨噬细胞中iNOS mRNA表达水平均无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);BCG+PD+SP组巨噬细胞中Fizz1 mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。结论:MAPK信号通路可能通过调控Mcl-1活性介导BCG感染巨噬细胞的极化进程,其中JNK通路发挥核心调控作用,p38与ERK通路协同参与调控。
关键词：生物信息学;;卡介苗;;巨噬细胞极化;;髓系细胞白血病序列1;;丝裂原活化蛋白激酶信号通路;;c-Jun氨基末端激酶
基金资助：新疆生产建设兵团科技局指导性科技计划项目（2022ZD045,2022ZD073）;; 新疆生产建设兵团教育局研究生创新项目（BTYJXM-2024-K63）;; 新疆生产建设兵团第八师指导性计划项目（2025ZDSF01）
