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作者：张育添;吴海灵;廖科棋;梁淑铃;李胜男;李友;
单位：广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室;广东医科大学附属医院神经病学研究所;
摘要：目的:构建针对小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3细胞肌动蛋白结合蛋白2 (TAGLN2)基因的慢病毒载体,并鉴定其沉默作用。方法:依据TA GLN2基因编码区设计短发夹RNA(shRNA)干扰靶点,将其扩增产物连接至经EcoRⅠ和AgeⅠ双酶切线性化的GV493慢病毒载体,构建GV493-TAGLN2-shRNA重组慢病毒载体,PCR法筛选阳性克隆并测序鉴定。将GV493对照慢病毒载体和GV493-TAGLN2-shRNA重组慢病毒载体分别转染至HEK293T细胞,收集纯化上清并测定病毒滴度。以感染复数(MOI)为100,分别感染bEnd.3细胞,感染48h更换含10 mg·L~(-1)嘌呤霉素的完全培养基筛选培养14 d。采用倒置荧光显微镜观察2组细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测2组细胞中TAGLN2 mRNA表达水平,Western blotting法检测2组细胞中TAGLN2蛋白表达水平。结果:荧光显微镜观察,转染后的HEK293T细胞中有强烈的GFP荧光信号,表明慢病毒包装体系构建成功。GV493对照慢病毒的滴度为5×10~(11) TU·L~(-1),TA GLN2干扰慢病毒滴度为6×10~(11) TU·L~(-1)。转染后,2组bEnd.3细胞均呈现明显GFP荧光信号,稳转细胞系构建成功。RT-qPCR法,与GV493对照组比较,GV493-TAGLN2-shRNA组细胞中TA GLN2 mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。Western blotting法,与GV493对照组比较,GV493-TAGLN2-shRNA组细胞中TAGLN2蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:成功构建靶向bEnd.3细胞TAGLN2基因的慢病毒载体,其可高效沉默TAGLN2表达。
关键词：肌动蛋白结合蛋白2;;稳定转染细胞系;;慢病毒;;bEnd.3细胞;;短发夹RNA
基金资助：国家自然科学基金项目（81571157）;; 广东省卫健委医学科研基金项目（A2022139,A2023193）;; 广东省湛江市科技局科技攻关计划项目（2021B01370）
