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作者：陈家辉;刘鸿博;黄路遥;姜雅轩;宋宏彬;
单位：中国人民解放军疾病预防控制中心;中国医科大学公共卫生学院流行病学教研室;
摘要：目的 利用CRISPR/Cas12f1系统靶向清除mcr-10.1耐药质粒，恢复细菌对黏菌素敏感性，为防控mcr-10.1耐药基因提供新手段。方法 构建含mcr-10.1的高拷贝耐药质粒pSEVA551-EGFP-mcr-10.1及模式耐药菌；遵循前间隔序列邻近基序（PAM）原则设计79条mcr-10.1靶点spacer，并选取3条最优靶点构建重组CRISPR质粒；以三个重组CRISPR质粒热激转化至模式耐药菌pmcr-10.1中为实验组；以空载体质粒pCas12f1转化至模式耐药菌pmcr-10.1中为对照组，开展琼脂电泳凝胶、荧光定量PCR(qPCR)、药敏试验（Etest）；将耐药质粒pSEVA551-EGFP-mcr-10.1转化至含有空载体pCas12f1质粒为对照组，转化至三组含有靶点的重组CRISPR质粒为实验组，开展质粒水平转移阻断实验。使用Graphpad Prism 10.1.2对数据和图形进行处理。结果 菌落PCR显示，三组CRISPR质粒实验组mcr-10.1清除率100.00%;qPCR表明，12h内靶点清除效率最高可达到92.00%,24h内靶点清除率均超90.00%，最高清除率可达99.22%，筛选出最优靶点；药敏试验显示，实验组黏菌素最小抑菌浓度（MIC）从对照组5.33μg/ml降至0.67～0.92μg/ml，恢复敏感性；耐药质粒转移实验中，实验组质粒转移量较对照组降低607～1 679倍。结论 CRISPR/Cas12f1系统可高效清除mcr-10.1耐药基因、逆转细菌耐药表型并阻断耐药质粒转移，且因体积小易递送，为黏菌素耐药性防控提供高效、可行的新策略。
关键词：细菌耐药;;CRISPR/Cas12f1系统;;耐药性清除;;黏菌素耐药基因
基金资助：国家自然科学基金（32141003）
