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作者：吴钊淳;李友;何嘉文;廖科棋;李胜男;
单位：广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室;广东医科大学附属医院神经病学研究所;
摘要：目的：构建PR锌指区域蛋白（PRDM） 5基因的过表达慢病毒载体，建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a，为探讨PRDM5在缺血性脑卒中（IS）发病机制中的作用奠定基础。方方法法：在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物，PCR法扩增获取PRDM5基因序列，将其与Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶双酶切后的慢病毒载体GV492进行连接，构建GV492-PRDM5过表达重组质粒，采用PCR法筛选并鉴定出的与目的基因片段长度相近的阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序正确的GV492-control质粒和GV492-PRDM5过表达重组质粒分别转染至人胚胎肾细胞HEK293T中，转染48 h后离心收集慢病毒，分别为GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒，采用慢病毒滴度测定法检测上述2种慢病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-control组和GV492-PRDM5组，分别使用GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞，慢病毒感染复数（MOI）为100，感染72 h后使用嘌呤霉素（10 mg·L~(-1)）对成功感染GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的Neuro-2a细胞进行筛选，通过荧光显微镜观察GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达情况。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平；Western blotting法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平。结果：PCR法，GV492-PRDM5重组质粒阳性转化子的长度约为684 bp, GV492-PRDM5过表达重组质粒基因序列与设计合成的PRDM5过表达序列一致；GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的滴度均为2.5×108 TU·mL~(-1)。荧光显微镜，GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态均良好，且能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-qPCR法，与GV492-control组比较，GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。Western blotting法，GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞在相对分子质量为75 000附近出现特异性条带；与GV492-control组比较，GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平升高（P<0.01）。结论：成功构建PRDM5过表达慢病毒载体，建立了稳定转染的GV492-PRDM5-Neuro-2a细胞。
关键词：PR锌指区域蛋白;;过表达慢病毒载体;;稳定表达;;Neuro-2a细胞
基金资助：国家自然科学基金项目（81571157）;; 广东省基础与应用基础研究基金委员会自然科学基金面上项目（2023A1515012750）;; 广东省卫健委医学科研基金项目（A2022139,A2023193）;; 广东医科大学百项青年研究项目资助计划项目（GDMUD2022010）
