来源：期刊VIP网 时间：
作者：周钰娇;杨继飞;刘岩;丁文博;张先宇;杨建宇;高林然;赵云冬;孙丽媛;
单位：北华大学医学技术学院临床病原学检验教研室;
摘要：目的：建立环介导等温扩增（LAMP）和簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白12a(Cas12a)(CRISPR/Cas12a)系统相结合的病原微生物快速检测方法，并评价其检测副溶血性弧菌（Vp）不耐热溶血毒素（tlh）基因的效果。方法：以Vp的tlh基因作为靶基因，设计LAMP引物和CRISPR RNA(crRNA)，构建并优化LAMP-CRISPR检测体系各成分最佳浓度配比，以蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌为对照组，建立快速检测Vp tlh基因的LAMPCRISPR/Cas12a方法，并对该方法的特异性、灵敏度、重复性和阳性符合率进行评价。结果：该方法能特异性检出Vp，蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均为阴性结果。Vp DNA提取浓度为190.67 mg·L~(-1)时吸光度（A）(260)/A(280)比值为1.84。在定量PCR(qPCR)仪37℃、80个循环、40 min反应条件下，LAMP-CRISPR/Cas12a体系中Cas12a蛋白和crRNA的浓度为50 nmol·L~(-1)时肉眼亮度及相对荧光强度峰高，检测Vp DNA浓度灵敏度可达10~(-6) mg·L~(-1)；重复性试验表明，不同实验人员在不同实验环境、不同时间重复检测结果一致。结论：建立的LAMP-CRISPR/Cas12a方法可以快速检测Vp的tlh基因，其灵敏度高、特异度强，可实现现场短时间的可视化检测。
关键词：副溶血性弧菌;;CRISPR-Cas12a系统;;tlh基因;;环介导等温扩增;;核酸检测
基金资助：吉林省科技厅科技发展计划项目（20230204085YY,20230202059NC）;; 北华大学研究生创新计划项目（[2023]071）
