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作者：李智敏;霍明歌;管龙雪;顾凡林;梁丹丹;刘倬睿;王国庆;关新刚;
单位：北华大学医学技术学院临床检验系;台州学院医学院基础医学系;
摘要：目的：制备表面表达程序性细胞死亡配体1(PD-L1)纳米抗体的细菌外膜囊泡（OMV），探讨其结构特性、细胞相容性、细胞内分布及其对程序性细胞死亡受体1(PD-1)/PD-L1信号轴的阻断效果。方法：构建pET28a-ClyA-PD-L1nb原核表达载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过超速离心法从转化PD-L1nb表达载体的BL21(DE3)单克隆菌落中分离OMV，利用组氨酸（His）标签进行蛋白纯化。采用透射电子显微镜和纳米粒径分析仪对OMV进行分析鉴定。将转化PD-L1nb表达载体的BL21(DE3)单克隆菌落所分离的OMV作为实验组，以未转化的BL21(DE3)单克隆菌落所分离的OMV作为对照组，采用Western blotting法检测2组OMV中ClyA-PDL1nb融合蛋白表达情况，采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测OMV处理后小鼠巨噬细胞RAW264.7、小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1和人胚胎肾细胞HEK293T活性，应用荧光成像技术观察OMV的肿瘤细胞内吞情况，采用流式细胞术检测PBS组、OMV-PD-L1nb组和aPD-L1+OMV-PDL1nb组OMV与肿瘤细胞表面PD-L1的结合效果。结果：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），大肠杆菌诱导后在预计相对分子质量（约49 000）附近出现明显加粗的蛋白条带，ClyA-PD-L1nb蛋白成功表达，纯化后泳道中无明显杂蛋白存在。利用超速离心法分离得到尺寸约120 nm的OMV-PD-L1nb，透射电子显微镜下呈现为尺寸均一的圆球形结构。Western blotting法，实验组OMV中检测到ClyA-PD-L1nb特异性条带。CCK-8法，经不同浓度OMV处理后，RAW 264.7细胞、4T1细胞和HEK293T细胞活性均接近100%。荧光成像，OMV-PD-L1nb被4T1细胞内吞后分散在细胞质中。与OMV-PD-L1nb组比较，aPD-L1+OMV-PD-L1nb组细胞中平均荧光强度明显降低（P<0.001）。结论：成功制备并分离了表面表达PD-L1nb的OMV即OMV-PD-L1nb，其在小鼠巨噬细胞、肿瘤细胞和人胚胎肾细胞上显示出良好的相容性，可被肿瘤细胞内吞并成功阻断PD-1/PD-L1信号通路。
关键词：细菌外膜囊泡;;程序性细胞死亡受体1;;程序性细胞死亡配体1;;纳米抗体;;免疫检查点阻断
基金资助：吉林省教育厅科研项目（JJKH20180370KJ）;; 浙江省科技厅自然科学基金探索一般项目（LY23C100001）;; 浙江省台州市科技局科技发展计划项目（22gya03）
