来源：期刊VIP网 时间：
作者：唐小茜;温升聪;董振亚;陈静仪;曹煜;张云华;
单位：石河子大学医学院生化教研室新疆地方与民族高发病教育部重点实验室;
摘要：目的：探讨血管生成素样蛋白6(ANGPTL6)在肝脏纤维化中的作用，分析工程化外泌体（Exo）递送ANGPTL6 mRNA对肝脏纤维化的改善作用。方法：将12只C57BL/6小鼠随机分为橄榄油组（OIL组）（腹腔注射橄榄油）和四氯化碳（CCl_4）组（腹腔注射橄榄油与CCl_4混合液），每组各6只；另12只C57BL/6小鼠，随机分为对照组（喂食含蛋氨酸胆碱对照饲料）和蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）组（喂食MCD饲料），构建2种小鼠肝脏纤维化模型，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blotting法检测各组小鼠肝组织中ANGPTL6 mRNA和蛋白表达水平。将30只小鼠随机分为橄榄油+磷酸盐缓冲液（PBS）组（OIL+PBS组）（腹腔注射橄榄油，每周2次，8周后，尾静脉注射PBS缓冲液6周，每周2次）、CCl_4+Exo-绿色荧光蛋白（GFP） mRNA组（腹腔注射CCl_4混合液制备肝纤维化模型后，尾静脉注射装载GFP mRNA的工程化Exo 6周）和CCl_4+Exo-ANGPTL6 mRNA组（腹腔注射CCl_4混合液制备肝纤维化模型后，尾静脉注射装载ANGPTL6 mRNA的工程化Exo 6周），每组10只。CCl_4+Exo-GFP mRNA组CCl_4+Exo-ANGPTL6 mRNA组小鼠每周注射工程化Exo 2次，每次每只小鼠注射20μg（体积100μL）。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性，Masson染色和天狼猩红染色观察各组小鼠肝脏胶原沉积情况，免疫组织化学法检测各组小鼠肝组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达水平，RT-qPCR法检测各组小鼠肝组织中α-SMA、Ⅰ型胶原α1链（Col1a1）、转化生长因子β1(TGF-β1)和金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1) mRNA表达水平。结果：生物信息学分析，ANGPTL6在活化肝星状细胞（aHSC）中表达明显下调。超声检查，OIL组小鼠肝脏表面细腻光滑；与OIL组比较，CCl_4组小鼠肝脏切面粗糙，表面凹凸不平。RT-qPCR和Western blotting法检测，与OIL组比较，CCl_4组小鼠肝组织中ANGPTL6 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。从HEK293T细胞上清液中提取的工程化Exo结构完整，经尾静脉注射后能够在纤维化肝脏中大量富集，GFP蛋白在肝脏中大量表达。ELISA法检测，与OIL+PBS组比较，CCl_4+Exo-GFP mRNA组小鼠血清中ALT和AST活性均明显升高（P<0.05）；与CCl_4+Exo-ANGPTL6 mRNA组比较，CCl_4+Exo-GFP mRNA组小鼠血清中ALT和AST活性均明显降低（P<0.05）。Masson染色和天狼猩红染色观察，与OIL+PBS组比较，CCl_4+Exo-GFP mRNA组小鼠肝脏胶原沉积明显增加，相对胶原面积增加（P<0.05）；与CCl_4+Exo-GFP mRNA组比较，CCl_4+Exo-ANGPTL6 mRNA组小鼠肝脏胶原沉积明显减少，相对胶原面积减少（P<0.05）。免疫组织化学法检测，与OIL+PBS组比较，CCl_4+Exo-GFP mRNA组小鼠肝组织中α-SMA蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与CCl_4+Exo-GFP mRNA组比较，CCl_4+ExoANGPTL6 mRNA组小鼠肝组织中α-SMA蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。RT-qPCR法检测，与OIL+PBS组比较，CCl4+Exo-GFP mRNA组小鼠肝组织中Col1a1、α-SMA、TGF-β1和TIMP-1 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）；与CCl_4+Exo-GFP mRNA组比较，CCl_4+Exo-ANGPTL6 mRNA组小鼠肝组织中Col1a1、α-SMA、TGF-β1和TIMP-1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05）。结论：小鼠尾静脉注射工程化Exo递送的ANGPTL6 mRNA主要富集在肝脏，工程化Exo递送ANGPTL6 mRNA对小鼠肝纤维化具有改善作用。
关键词：血管生成素样蛋白6;;工程化外泌体;;肝脏纤维化;;肝脏损伤;;疾病模型,动物
基金资助：国家自然科学基金项目（82260126,32460221）
