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作者：施玉怡;甘盛琦;刘澈;程子文;程廓;杨宝玲;王大为;
单位：锦州医科大学畜牧兽医学院基础兽医学教研室;锦州医科大学基础医学院病原生物学教研室;
摘要：目的：对弓形虫硫氧还蛋白20(Trx20)进行表达纯化、抗体制备和亚细胞定位分析，为弓形虫疫苗的研制提供参考。方法：采用生物信息学相关网站及软件对Trx20蛋白进行生物信息学分析，设计特异性引物进行目的片段扩增和原核表达载体构建，进行蛋白质的体外表达和纯化。免疫实验动物进行抗体制备，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测多克隆抗体效价，Western blotting法验证抗体的特异性和灵敏度以及确定该蛋白的天然表达情况，间接免疫荧光法（IFA）分析蛋白的亚细胞定位。结果：生物信息学分析，Trx20蛋白是一种较稳定的亲水性蛋白，分子式为C_(2172)H_(3412)N_(548)O_(616)S_(20)，含有424个氨基酸，预测相对分子质量为47 700，理论等电点为8.55；预测该蛋白存在1个信号肽，无跨膜区，含有1个名为“Thioredoxin like Superfamily”的结构域，并含35个磷酸化位点、1个N-糖基化位点和17个抗原决定簇；二级结构中α螺旋占氨基酸总数的41.51%，无规则卷曲占39.86%；成功构建重组质粒pET-28a-Trx20和pGEX-4T-1-Trx20，实现了可溶性重组蛋白的表达和纯化；成功制备多克隆抗体，效价高达1∶64 000，且对Trx20蛋白具有特异性识别能力；亚细胞定位，Trx20蛋白在虫体细胞质中广泛分布。结论：刚地弓形虫Trx20蛋白是一种含有磷酸化/糖基化修饰位点和硫氧还蛋白结构域，且为定位于虫体胞质中的分泌型蛋白质。
关键词：刚地弓形虫;;硫氧还蛋白20;;亚细胞定位;;蛋白纯化;;多克隆抗体
基金资助：辽宁省教育厅青年基金项目(JYTQN2023433,JYTQN2023435)
