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作者：苏秋源;赵玲;谭佳佳;莫世恩;周海琴;卢芳芳;韦依;周洋;况燕;
单位：广西医科大学第一附属医院妇科;广东省广州市第一人民医院妇科;
摘要：目的：构建鞘氨醇激酶1(SPHK1)过表达慢病毒载体，建立SKOV3慢病毒稳定转染细胞系。方法：根据美国生物技术信息中心（NCBI）数据库提供的SPHK1的数据信息设计并合成引物，扩增目的基因，连接至经Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶处理的GV492质粒，构建SPHK1过表达慢病毒载体，选取阳性克隆进行PCR和测序鉴定。将慢病毒质粒和慢病毒包装辅助质粒共同转染至HEK-293T细胞进行包装和滴度测定。根据测得的最佳感染复数（MOI）为10，将各组相应的慢病毒量转染至SKOV3细胞，分为空白组（不进行处理）、GV492对照组（GV492对照慢病毒感染SKOV3细胞）和GV492-SPHK1过表达组（GV492-SPHK1过表达慢病毒感染SKOV3细胞，ov-SPHK1组）。使用最佳浓度为2 mg·L~(-1)的嘌呤霉素筛选稳定转染的SKOV3细胞系，48 h后换液，更换浓度为1 mg·L~(-1)嘌呤霉素筛选14 d，荧光显微镜下观察细胞形态和荧光表达情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组SKOV3细胞中SPHK1 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组SKOV3细胞中SPHK1蛋白表达水平。结果：PCR测序，SPHK1过表达慢病毒载体基因序列与目标序列完全一致，成功构建SPHK1过表达慢病毒载体，GV492对照组和ov-SPHK1组慢病毒滴度分别为5×10~(11)及8×10~(11) TU·L~(-1)。GV492对照组和ov-SPHK1组SKOV3细胞状态良好，荧光表达强烈，提示成功构建SPHK1过表达的SKOV3稳定转染细胞系。RT-qPCR法检测，与空白组和GV492对照组比较，ov-SPHK1组SKOV3细胞中SPHK1 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。Western blotting法检测，与空白组和GV492对照组比较，ov-SPHK1组SKOV3细胞中SPHK1蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。结论：成功构建了SPHK1过表达慢病毒载体，并建立了稳定转染的SKOV3细胞。
关键词：鞘氨醇激酶1;;SKOV3细胞;;慢病毒;;稳定转染细胞系;;卵巢肿瘤
基金资助：国家自然科学基金项目(82260566,81960466)
