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作者：朱海东;吕长坤;师玮;
单位：商丘医学高等专科学校基础医学部;
摘要：目的：探讨盐酸小檗碱（BBR）对1型单纯疱疹病毒（HSV-1）感染HeLa细胞自噬的影响，并阐明其相关机制。方法：将处于对数生长期的HeLa细胞分别加入0、10、20、40、80、120和160μmol·L~(-1) BBR中培养24 h。另将HeLa细胞分为HSV-1组（感染HSV-1）、 L-BBR组（感染HSV-1后，用20μmol·L~(-1) BBR处理24 h）、M-BBR组（感染HSV-1后，用40μmol·L~(-1) BBR处理24 h）、H-BBR组（感染HSV-1后，用80μmol·L~(-1) BBR处理24 h）和740 Y-P组（感染HSV-1后，用80μmol·L~(-1) BBR和10μmol·L~(-1) 740 Y-P处理24 h），进行病毒感染及相应的药物处理。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测检测不同浓度BBR处理HeLa细胞活性，空斑减数实验检测各组HeLa细胞中HSV-1增殖能力，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组Hela细胞中病毒复制相关基因mRNA表达水平，免疫荧光法检测各组Hela细胞中微管相关蛋白1轻链3(LC3)自噬小体形成情况，流式细胞术检测各组Hela细胞凋亡率，Western blotting法检测各组Hela细胞中自噬及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路相关蛋白表达水平。结果：MTT法检测，与0μmol·L~(-1) BBR组比较，120和160μmol·L~(-1) BBR组HeLa细胞活性明显降低（P<0.05），对细胞具有一定毒性；选择20、40和80μmol·L~(-1) BBR进行后续实验。空斑减数实验检测，与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中空斑形成单位（PFUs）明显减少（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中PFUs明显增加（P<0.05）。RT-qPCR法检测，与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组感染细胞蛋白0(ICP0)、感染细胞蛋白22(ICP22)、感染细胞蛋白8(ICP8)、胸苷激酶（TK）、糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD) mRNA表达水平均明显降低（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中ICP0、ICP22、ICP8、TK、gB和gD mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）。免疫荧光法检测，与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中LC3自噬小体形成数量增加；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中LC3自噬小体形成数量减少。流式细胞术检测，与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞凋亡率明显升高（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞凋亡率明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测，与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中苄氯素1(Beclin-1)及B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)/腺病毒E1B 19kDa蛋白相互作用蛋白（BNIP）蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中Beclin-1和BNIP蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显降低（P<0.05）；与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)和Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中Caspase-1、Caspase-3和Bax蛋白表达水平明显降低（P<0.05）, Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与HSV-1组比较，L-BBR组、M-BBR组和H-BBR组HeLa细胞中磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K、磷酸化AKT(p-AKT)/AKT和磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR比值均明显降低（P<0.05），并呈剂量依赖性；与H-BBR组比较，740 Y-P组HeLa细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值均明显升高（P<0.05）。结论：BBR能够促进HSV-1病毒感染HeLa细胞的自噬过程，诱导自噬依赖性凋亡，并显著抑制病毒的复制，其作用机制与调控PI3K/AKT/mTOR通路有关。
关键词：盐酸小檗碱;;磷脂酰肌醇3-激酶;;蛋白激酶B;;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路;;1型单纯疱疹病毒;;自噬
基金资助：河南省科技厅科技发展计划项目(242102310081)
