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作者：冯思凡;李昀峰;王嘉营;马福槟;王岩;
单位：广东医科大学附属医院神经病学研究所广东省衰老相关心脑疾病重点实验室;广东省高州市人民医院神经内科;
摘要：目的：探讨血红素结合蛋白1(HEBP1)基因下调对小胶质细胞BV2功能的影响，分析HEBP1在小胶质细胞中发挥的关键作用。方法：构建阴性对照和HEBP1敲减的小干扰RNA(siRNA)，敲减鼠源的小胶质细胞BV2中的HEBP1基因，获得HEBP1敲减BV2细胞模型。BV2细胞分为si-NC组、si-HEBP1-1组、 si-HEBP1-2组和si-HEBP1-3组，采用实时荧光定量PCR法（RT-qPCR）法和Western blotting法检测细胞敲减后HEBP1 mRNA和蛋白表达水平，筛选出敲减效果最显著的siRNA用于后续实验。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测si-NC组和si-HEBP1组BV2细胞增殖活性，细胞划痕实验检测2组BV2细胞迁移率，试剂盒检测2组BV2细胞中线粒体膜电位和活性氧（ROS）水平，线粒体呼吸功能测定仪检测2组BV2细胞线粒体呼吸功能。BV2细胞分为si-NC组、si-NC+脂多糖（LPS）组、si-HEBP1组和si-HEBP1+LPS组，RT-qPCR法检测各组BV2细胞中HEBP1、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6) mRNA表达水平，Western blotting法检测各组BV2细胞中HEBP1蛋白表达水平。结果：携带红色荧光标签CY3的siRNA转染BV2细胞，转染效率可达90%以上；与si-NC组比较，si-HEBP1-1组、si-HEBP1-2组和si-HEBP1-3组BV2细胞中HEBP1蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），其中si-HEBP1-1组降低最明显；与si-NC组比较，si-HEBP1-1组、si-HEBP1-2组和si-HEBP1-3组BV2细胞中HEBP1 mRNA表达水平均明显降低（P<0.01），其中si-HEBP1-1组降低最明显，提示si-HEBP1-1是HEBP1敲减效果最好的siRNA,HEBP1敲减的BV2细胞模型构建成功。CCK-8法检测，与si-NC组比较，si-HEBP1组BV2细胞增殖活性明显降低（P<0.05或P<0.01）；从90 min开始，2组细胞增殖活性差异更加明显。细胞划痕实验，与si-NC组比较，si-HEBP1组细胞迁移率明显降低（P<0.05）。荧光显微镜观察，与si-NC组比较，si-HEBP1组细胞线粒体膜电位明显降低（P<0.05）；与si-NC组比较，si-HEBP1组BV2细胞中ROS水平明显升高（P<0.05）。细胞线粒体呼吸功能测定，与si-NC组比较，si-HEBP1组BV2细胞基础呼吸值（ROUNTINE）和细胞质子漏耗氧量（LEAK）均明显降低（P<0.05或P<0.01）,2组细胞电子传递呼吸值（ETS）和剩余耗氧量（ROX）差异均无统计学意义（P>0.05）；与si-NC组比较，si-HEBP1组BV2细胞三磷酸腺苷（ATP）生成量明显减少（P<0.05）。RT-qPCR法检测，与si-NC组比较，si-NC+LPS组BV2细胞中IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA水平均明显升高（P<0.01）；与si-HEBP1组比较，si-HEBP1+LPS组BV2细胞中IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA水平均明显升高（P<0.01）；与si-NC+LPS组比较，si-HEBP1+LPS组BV2细胞中IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA表达水平均明显升高（P<0.01）。结论：敲减HEBP1基因可降低小胶质细胞BV2增殖和迁移能力，并增强对LPS刺激的炎症反应，其机制可能与BV2细胞线粒体功能受损和ATP产生减少有关。
关键词：血红素结合蛋白1;;小胶质细胞;;线粒体功能;;神经炎症;;活性氧;;细胞增殖;;细胞迁移
基金资助：广东省科技厅自然科学基金基础与应用基础研究面上项目（2024A1515011464,2022A1515010593）;; 广东医科大学附属医院高层次人才科研启动项目（GCC2021010）
