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作者：王家宁;刘永娟;冉凯凯;孙宾莲;史颖颖;
单位：江汉大学湖北省认知与情感障碍重点实验室;江汉大学基础医学院免疫学教研室;徐州医科大学附属连云港市第一人民医院中心实验室;武汉迈思生物科技有限公司;
摘要：目的：构建柯萨奇病毒A16型（CA16）病毒病毒蛋白1(Vp1)的原核表达载体，并在大肠杆菌（E. coli） BL21中进行表达，纯化蛋白后制备兔多克隆抗体并对抗体免疫反应性进行鉴定。方法：利用生物信息学在线工具对Vp1蛋白氨基酸组成、保守结构域、二级和三级结构进行预测。扩增CA16的Vp1基因，并将其克隆至原核表达载体pET28a（+）中。将pET28a-Vp1转化E. coli BL21，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。采用Western blotting法鉴定Vp1蛋白诱导表达情况，并优化诱导时间和温度以提高表达效率。取2只雌性SPF新西兰大白兔，将纯化的重组蛋白Vp1免疫兔，制备兔抗Vp1蛋白多克隆抗体，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定抗体效价，Western blotting法对抗体的免疫反应性进行鉴定。结果：生物信息学分析，Vp1基因编码297个氨基酸，相对分子质量为33 046.39，等电点为8.32，属于亲水性蛋白；二级结构中α-螺旋占15.15%，无规则卷曲占67.68%，延伸链占17.17%。重组质粒pET28a-Vp1测序，pET28a-Vp1质粒构建正确。Western blotting法检测，IPTG诱导组于相对分子质量33 000处有目的蛋白表达，目的蛋白主要表达于包涵体中。蛋白最佳诱导表达条件为IPTG浓度0.4 mmol·L~(-1)、温度16℃和诱导时间20 h。ELISA法检测，兔多克隆抗体效价为1∶1 024 000。Western blotting法检测，Vp1兔多克隆抗体可以与CA16感染细胞中的病毒Vp1蛋白结合。结论：成功制备出抗CA16 Vp1的多克隆抗体，该抗体对CA16 Vp1具有明显的结合特性，可用于肠道病毒感染的诊断及治疗方法的开发。
关键词：柯萨奇病毒A16型;;病毒蛋白1;;原核表达;;多克隆抗体;;大肠杆菌
基金资助：国家自然科学基金青年基金项目（82202494）;; 湖北省科技厅自然科学基金项目（2018CFB254）;; 湖北省武汉市卫健委新冠肺炎应急科研专项项目（EX20D04）;; 江汉大学校级科研资助计划项目（2023KJZX27）
