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作者：刘义;何婷婷;齐建荣;李浩;祝丙华;
单位：南方医科大学公共卫生学院;中国人民解放军第三〇五医院疾控科;中国人民解放军总医院第五医学中心检验科;病原微生物生物安全国家重点实验室;
摘要：目的 建立一种基于酶促重组等温扩增-成簇规律间隔短回文重复序列Cas12a蛋白（ERA-CRISPR/Cas12a）的肺炎克雷伯菌（KP）核酸检测方法。方法 针对KP(fimI)基因设计3条CRISPR RNA(crRNA)，以含该基因的质粒为模板进行ERA扩增，通过CRISPR/Cas12a荧光反应筛选出最佳的crRNA。设计3对靶序列的ERA引物并构建9组引物组合，从中筛选出一组作为ERA-CRISPR/Cas12a反应的最佳引物，结合消线法核酸检测试纸技术（ERASE）建立完整检测体系。以十倍梯度稀释的fimI基因质粒为模板检测方法灵敏度；同时对KP和其他4种临床常见革兰阴性杆菌进行检测评价其特异性；检测34株临床分离株核酸，并与荧光定量PCR(qPCR)结果对比。结果 成功建立ERA-CRISPR/Cas12a检测体系，灵敏度试验中，质粒模板的荧光检测最低检出限（LOD）为1copy/μl,ERASE试纸为10copies/μl，均优于qPCR(100copies/μl)；特异性试验中，仅KP检测结果呈阳性；34株临床分离株中30株KP均被检出，与qPCR结果一致。结论 本研究成功建立了一种简便、经济且兼具高灵敏度与高特异性的KP核酸检测方法，该方法适用于经济欠发达地区的基层卫生机构开展核酸检测工作。
关键词：成簇规律间隔短回文重复序列;;等温扩增;;肺炎克雷伯菌;;核酸检测;;消线法核酸检测试纸
基金资助：国家重点研发计划（2023YFC2605101）
