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作者：李雨晴;邵杨柳;李梦月;王莉莉;高晓宁;
单位：中国人民解放军总医院第五医学中心血液病医学部;解放军医学院;
摘要：目的:通过MeRIP联合逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术，证明WTAP介导的RNA m~6A修饰对伴t(8;21)急性髓系白血病(AML)细胞中KDM4B基因的直接调控作用。方法:采用靶向WTAP或KDM4B基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体沉默t(8;21)AML细胞系Kasumi-1和SKNO-1中WTAP或KDM4B基因表达，以转染随机打乱序列(scramble)的shRNA的细胞为对照。用超纯RNA提取试剂盒(DNaseⅠ)提取细胞RNA,Magna MeRIP~(TM) m~6A Kit试剂盒富集甲基化修饰片段，并通过RT-qPCR检测m~6A甲基化修饰的RNA区域；采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)和逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测细胞中WTAP、KDM4B蛋白和mRNA的表达水平。采用克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力。结果:沉默Kasumi-1细胞中WTAP的表达后，m~6A甲基化修饰在KDM4B mRNA 3’UTR的富集程度显著下降(P<0.01),沉默Kasumi-1和SKNO-1细胞中WTAP的表达可显著抑制KDM4B蛋白(P<0.001)和mRNA表达水平(Kasumi-1:P<0.001; SKNO-1:P<0.01)、细胞体外克隆形成能力下降(Kasumi-1:P<0.001; SKNO-1:P<0.01)。结论:t(8;21) AML细胞系中，WTAP通过调控KDM4B基因mRNA 3’UTR的m~6A修饰调控KDM4B的表达，沉默KDM4B表达可以抑制t(8;21)AML细胞增殖。
关键词：MeRIP-qPCR;;急性髓系白血病;;t(8;21)染色体易位;;KDM4B;;RNA m~6A甲基化修饰
基金资助：国家自然科学基金(82070149,81870109);; 北京市自然科学基金(7202191)
