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作者：李天逸;江淼;黄璐璐;韩晶晶;马珍妮;白霞;夏利军;
单位：苏州大学附属第一医院,江苏省血液研究所,国家血液系统疾病临床医学研究中心,国家卫生健康委员会血栓与止血重点实验室,血液学协同创新中心;放射医学与辐射防护国家重点实验室(苏州大学);苏州大学附属独墅湖医院;
摘要：目的：研究人蛋白C基因（PROC）N355S、G392E、T314A点突变致蛋白C(PC)功能缺陷的分子机制。方法：构建PROC基因野生型和突变型质粒（PC_(WT)、PC_(N355S)、PC_(G392E)、PC_(T314A)）并瞬时转染至HEK293细胞，进行突变蛋白的体外表达试验，用实时荧光PCR检测野生型和突变型PC转染24 h后的m RNA水平变化。Western blot和ELISA分别检测野生型及突变PC细胞内外蛋白水平变化。将转染24-48 h的细胞上清液进行超滤浓缩，对浓缩液中的蛋白进行定量，并进行PC的激活和酶动力学试验。Clustal Omega多序列比对分析氨基酸突变位点的保守性。利用Py MOL软件分析突变对PC蛋白质结构造成的影响。结果：PC_(N355S)、PC_(G392E)、PC_(T314A)组PROC m RNA相对表达量分别为1.14±0.46、0.96±0.08和1.08±0.17，与PCWT组的1.02±0.24相比均无显著差异（P>0.05）。转染细胞裂解物的Western blot分析结果显示，PC_(T314A)重组蛋白的含量略降低，条带相对较浅。浓缩细胞培养上清液的ELISA结果显示，PC_(N355S)、PC_(G392E)的PC:Ag水平分别为98.8%±2.4%、101.4%±3.1%，与PCWT相比无明显差异，而PC_(T314A)的PC:Ag水平（88.6%±3.2%）则较PCWT有所下降（P<0.05）。酶动力学试验的结果表明，APC_(N355S)(K_m=338.3±43.2,V_(max)=2.015±0.12)、APC_(G392E)(K_m=292.2±28.4,V_(max)=1.893±0.07)和APC_(T314A)(K_m=299.5±24.6,V_(max)=1.775±0.06)与APC_(WT)(K_m=238.2±4.58,V_(max)=3.205±0.06)相比，均表现为Km值的升高和Vmax的下降。多序列比对提示，3种突变在不同物种中均具有高度保守性。结构模型提示，N355S、G392E、T314A突变的氨基酸替换与周围的氨基酸基团产生碰撞，使周围的结构产生扭曲，对PC的折叠和发挥生物学功能产生不利影响。结论：PROC基因的N355S、G392E和T314A突变通过减弱PC与底物间的结合导致PC的功能缺陷。这3种突变在蛋白结构上产生了严重的空间碰撞，影响了PC的折叠和活性位点的反应性。
关键词：蛋白C;;蛋白C缺陷;;基因突变;;结构分析
基金资助：江苏高校优势学科建设工程（临床医学）;; 江苏省科技项目面上项目（BK20201170）;; 苏州市科技项目（SZM2022001）
