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作者：和艳敏;吴知盼;何吉;章伟;朱发明;
单位：浙江省血液中心输血研究所;
摘要：目的:建立一种HLA-Ⅰ类分子高效基因编辑的方法，以制备编辑HLA-Ⅰ类通用型造血干细胞。方法:针对β2微球蛋白基因设计并合成sgRNA,将NLS-Cas9-NLS核酸酶与sgRNA按照不同的摩尔比(1∶1-1∶4)形成RNP复合物，分别设置对照组和四个转染组，通过核转染方式转入HEK-293细胞或者CD34~+造血干细胞。培养72 h后，应用流式细胞术检测转染细胞表面HLA-Ⅰ类分子表达情况，T7E1酶切反应鉴定切割作用，DNA直接测序方法鉴定序列套峰出现情况。结果:流式细胞术检测发现转染后HEK-293细胞或者CD34~+造血干细胞有不同程度的HLA-Ⅰ类分子阴性表达细胞群，直接测序不同转染组在sgRNA PAM序列附近均有明显套峰出现。在HEK-293细胞转染中，NLS-Cas9-NLS核酸酶与sgRNA摩尔比为1∶4时HLA-Ⅰ类分子阴性表达细胞群比例最高(87.69±0.83)%,摩尔比为1∶3时T7E1酶切割效率最高(38±2.0)%。在CD34~+造血干细胞转染中，NLS-Cas9-NLS核酸酶与Easyedit sgRNA摩尔比为1∶2时，HLA-Ⅰ类分子阴性表达细胞群比例为(91.56±3.39)%,摩尔比为1∶1时T7E1酶切割效率为64±8.45%。结论:本研究提供了一种针对HLA-Ⅰ类分子进行高效基因编辑的方法，该方法可以有效地将细胞表面的HLA-Ⅰ类分子进行沉默表达，并成功应用于编辑CD34~+造血干细胞。
关键词：CRISPR/Cas9;;HLA-Ⅰ类分子;;β2微球蛋白基因;;造血干细胞
基金资助：浙江省自然基金项目(LTGY23H80002)
