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作者：陈亚利;王倩;刘涵;宗志友;满淑丽;孙媛霞;陈朋;
单位：天津科技大学生物工程学院;中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程研究中心;
摘要：为获得异源表达水平与酶学性质良好的α-葡聚糖磷酸化酶并考察结构域对酶的影响，研究通过数据库挖掘和序列分析，获得了来源于超级嗜热古菌Thermococcus sp. EP1的新型α-葡聚糖磷酸化酶TsGP。利用AlphaFold2预测三维结构确定TsGP的C端为非催化结构域后，构建了C端截短的突变体ΔTsGP。在E. coli BL21(DE3)中对TsGP与ΔTsGP进行异源重组表达，并对其酶学性质进行了表征。结果表明，ΔTsGP在大肠杆菌中的表达水平较TsGP提高了3.76倍。在最适反应温度为70℃时，ΔTsGP的比酶活为23.87 U/mg，较TsGP提高1.3倍。在50～65℃的工业酶催化条件下，ΔTsGP的热稳定性与TsGP相当，且酶活力更高。此外，ΔTsGP与TsGP具有相同的底物特异性，最小底物为麦芽三糖，且随着底物链长的增加，比酶活逐渐提升。以麦芽七糖为底物，ΔTsGP的k_(cat)值为37.09 s~(-1)，比TsGP提高了1.21倍，但底物亲和力（K_m=3.30 mmol/L）降低了2.77倍。研究通过结构分析与非催化结构域截短策略成功提高了TsGP在大肠杆菌中的表达水平和工业酶催化条件下的比酶活。这为αGP酶蛋白的高效表达与应用提供了借鉴，并为进一步通过工程改造优化其性能奠定了基础。
关键词：嗜热α-葡聚糖磷酸化酶;;葡萄糖-1-磷酸;;非催化结构域;;蛋白截短;;酶学性质
基金资助：国家重点研发计划（2022YFC2104901）;; 国家自然科学基金（42106124）;; 天津市合成生物技术创新能力提升行动（TSBICIP-CXRC-077）
