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作者：王帅;邓木兰;+;梁志成;周泓宇;何少媚;张智;穆云萍;李芳红;赵子建;
单位：广东工业大学生物医药研究院;华南理工大学医学院;深圳大学生命与海洋科学学院;
摘要：基于pyrF筛选标记和来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis,L. lactis）的基因组DNA为表达元件，构建L. lactis食品级表达载体，用于食品和药用多肽的表达和生产。首先，利用NZ3900 pyrF基因列构建同源重组突变盒，构建NZ3900ΔpyrF突变株；然后，分别以来源于L. lactis的repA和repC基因为复制元件、pyrF基因为筛选标记、P_(32)和P_8为启动子、以及Tusp_(45)和TpepN为终止子，构建食品级表达质粒pLD；最后以绿色荧光蛋白ZsGreen为报告基因，验证ZsGreen在NZ3900ΔpyrF突变株的表达及pLD-ZsG的遗传稳定性。实验结果表明，原养型ZsGreen阳性转化子可在普通Elliker培养基中正常生长，在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号；此外，PCR和Western blotting也证实ZsGreen能在NZ3900中表达且能稳定传代至30代，说明pLD食品级表达载体构建成功且使得外源蛋白在L. lactis中稳定表达。综上所述，基于pyrF营养缺陷型标记构建的L. lactis食品级表达载体的方法切实可行，可为推动L. lactis在食品和药用多肽生产中的应用提供研究基础。
关键词：pyrF;;乳酸乳球菌;;食品级表达载体;;筛选标记;;绿色荧光蛋白
基金资助：国家重点研发计划项目（2018YFA0800603）;; 国家自然科学基金青年项目（82100064）;; 广东省“珠江人才计划”项目（2016ZT06Y432）;; 广东省重点领域研发计划项目（2019B020201015）
