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作者：吴海星;黄安妮;高霞;申铉日;夏光华;张雪莹;
单位：海南大学食品科学与工程学院,南海水产资源高效利用工程研究中心,海洋食品精深加工海口市重点实验室,国家对虾加工技术研发分中心(海南);大连理工大学,海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心;
摘要：目的：对来源于Lysinibacillus sphaericus的胶原酶LsCol1进行异源表达、纯化、酶学性质及底物特异性研究，并用于水解罗非鱼皮胶原蛋白制备抗氧化活性肽，以期为新型胶原酶资源的开发及其在生物活性肽制备中的应用提供理论依据。方法：使用序列分析工具BLAST、Clustal Omega等分析LsCol1的氨基酸序列，利用AlphaFold 3预测其三维结构，借助化学合成技术获得LsCol1的基因序列全长并在Escherichia coli中异源表达，使用镍亲和层析色谱分离纯化LsCol1，研究其酶学特性及底物特异性，最后利用LsCol1水解罗非鱼皮胶原蛋白制备抗氧化活性肽。结果：LsCol1基因序列全长为3219 bp，编码1072个氨基酸，N端含有催化域，C端附属结构域由一个多囊肾病样结构域和两个胶原结合结构域组成。纯化后的重组胶原酶LsCol1分子量为120 kDa，最适反应温度和p H分别为37℃和7.5，在低于30℃和pH7.0～10.0范围内稳定性较好，Ca~(2+)对LsCol1的酶活力呈促进作用。底物特异性实验结果表明，LsCol1的最适作用底物为罗非鱼皮胶原蛋白。以罗非鱼皮胶原蛋白为底物制备的水解物具有良好的抗氧化活性，当水解物浓度为4 mg/mL时，其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基和羟基自由基清除率分别为65.9%、97.6%和32.1%。结论：L.sphaericus来源的重组胶原酶LsCol1具有良好的催化活性，在抗氧化活性肽制备方面具有潜在的应用价值。
关键词：胶原蛋白;;胶原酶;;酶学特性;;胶原蛋白水解物;;抗氧化活性
基金资助：海南省重点研发计划项目（ZDYF2020172）;; 海南省自然科学基金（322RC587）;; 海南大学科研启动基金项目（KYQD(ZR)20046）
