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作者：李荷月;郭煜辉;裴雯雯;王倩;李娇;赵伟;秦慧民;孙媛霞;陈朋;
单位：天津科技大学生物工程学院;中国科学院天津工业生物技术研究所,工业酶国家工程研究中心;中国科学院天津工业生物技术研究所,低碳合成工程生物学全国重点实验室;山东福洋生物科技股份有限公司;
摘要：本研究旨在通过半理性设计策略同时提高黑曲霉(Aspergillus niger)来源葡萄糖氧化酶(AnGOD)酶活性与热稳定性。基于FireProt在线工具与序列一致性分析设计突变位点，通过定点突变及两阶段组合突变筛选最优突变体，并利用分子动力学模拟解析其性能提升机制。结果表明，从83个设计位点中筛选出12个单点优势突变体，经两阶段组合突变获得最优突变体M5(T276F/T34V/Q90R/S53F/S74T)。M5的比酶活较野生型(WT)提高4.2倍，k_(cat)值为755.0 s~(-1)，催化效率(k_(cat)/K_m)为34.52 L·mmol~(-1)·s~(-1)，分别为WT的3.67、2.48倍。在65℃下，M5的半衰期为30 min，较WT(1 min)提高了30倍。分子动力学模拟表明，M5的RMSD均值与非催化区RMSF均值较WT分别降低了12.9%与12.4%，与底物及辅酶之间的氢键数量分别增加10.3%与8.8%，此外，S74T新增氢键网络，Q90R突变引入正电荷，增强表面静电互补，这些因素共同提升了AnGOD的热稳定性与催化活性。本研究通过半理性设计与组合突变策略，显著缓解了AnGOD酶改造中热稳定性与催化活性的权衡问题，为GOD的应用奠定了基础。
关键词：葡萄糖氧化酶;;活性与稳定性权衡;;半理性设计;;一致性分析;;分子动力学模拟
基金资助：国家重点研发计划（2022YFC2104900）;; 山东省重点研发计划（重大科技创新工程）项目（2023CXGC010714）;; 合成生物学海河实验室重大攻关类项目（22HHSWSS00003）
