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作者：叶光斌;幸洪静;杨志阳;宗绪岩;
单位：四川轻化工大学生物工程学院;四川轻化工大学,酿酒生物技术及应用四川省重点实验室;
摘要：大曲是中国传统白酒典型的“多酶多菌”的发酵剂。免培养的分子生物学方法已经成为大曲微生物群落研究的常规方法。通过评估不同DNA提取方法对大曲基因组DNA提取效果及扩增子文库的影响，选择适合用于大曲DNA提取的最佳方法。该研究选择4种DNA提取方法分别对2种大曲进行大曲微生物DNA的提取，结合DNA提取质量、qPCR定量结果、细菌16S rRNA基因和真菌ITS基因扩增子文库的Illumina Miseq测序结果，评估大曲基因组DNA不同提取方法的效果。从DNA得率和生物量的综合分析表明，SDS-based提取法的DNA得率高于试剂盒提取法，其中原位SDS-based提取法DNA得率高达5.46×10~4 ng/g,但DNA纯度较低；SDS-based提取法的qPCR定量结果比试剂盒提取法高10~1～10~6量级，其中洗脱加SDS-based提取法的微生物生物量最高，比原位SDS-based提取法的生物量高10~1～10~3量级；试剂盒提取法的微生物生物量最低，细菌和真菌的生物量只有10~2～10~4 copies/g。扩增子文库间Shannon多样性指数的比较结果表明，不同DNA提取方法在真菌ITS扩增子文库间存在显著差异，而在细菌16S rDNA扩增子文库间差异不显著。洗脱处理样本的真菌扩增子文库Shannon指数要高于原位处理的样本。通过对扩增子文库间存在显著性差异操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)的比较可以看出，在细菌16S rDNA扩增子文库中，多数OTUs存在丰度差异，但它们大多数能在不同DNA提取方法中检测到；然而在真菌ITS扩增子文库间，少数OTUs在不同DNA提取方法中检测不到，说明DNA提取方法对部分真菌微生物基因组的提取存在显著影响，且洗脱处理有利于真菌基因组DNA的提取。综合对比4种DNA提取方法，洗脱加SDS-based提取法最适合用于大曲微生物的定量和群落结构分析。
关键词：DNA提取方法;;大曲;;扩增子文库;;微生物群落;;qPCR;;Illumina Miseq测序
基金资助：四川省科技厅重点研发项目(2022YFS0547);; 酿酒生物技术及应用四川省重点实验室开放基金项目(NJ2014-09)
