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作者：管杏子;周景文;邱洁茹;张妮;刘松;
单位：江南大学,未来食品科学中心;江南大学生物工程学院;
摘要：磷脂酶D(phospholipase D,PLD;EC 3.1.4.4)可催化卵磷脂转化为功能性磷脂，在食品和医药领域具有重要应用价值。该研究首次在茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)中建立PLD高效异源表达系统，并解析其酶学特性及催化性能。基于CRISPR-Cas9基因编辑系统，将来源于Streptomyces racemochromogenes 10-3的PLD基因整合至S.mobaraensis DSM40587的谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase, TGase)基因位点，成功构建重组菌株SM-PLD1。摇瓶发酵36 h后胞外PLD酶活力达131.20 U/mL。通过启动子工程策略，采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶强启动子Pgapdh替换SM-PLD1中的TGase启动子，得到的重组菌株SM-PLD2的酶活力较SM-PLD1提高48%至194.29 U/mL。在此基础上，在壳聚糖酶基因座插入第二拷贝PLD基因表达盒，得到重组SM-PLD2d酶活力提升至244.66 U/mL,较初始菌株SM-PLD1提高了86%。纯化后的重组PLD比酶活力达726.31 U/mg,最适反应条件为50℃和pH 7.5,且在30～50℃下保温2 h后仍保留50%以上活性，表现出优异的稳定性。此外，以2-甲基四氢呋喃为反应介质，PLD成功催化磷脂酰丝氨酸合成。研究结果为PLD的规模化制备及功能磷脂绿色合成提供了理论依据和技术支撑。
关键词：磷脂酶D;;CRISPR-Cas9;;茂原链霉菌;;酶学性质;;磷脂酰丝氨酸
基金资助：广东省科技计划项目(2024B1111160001);; 国家自然科学基金项目(32071474)
