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作者：袁书鸣;李丛旭;李琛;施昌倩;周贤轩;
单位：合肥工业大学食品与生物工程学院;
摘要：肝素作为一种高度硫酸化的糖胺聚糖，具备抗凝血、抗血脂、抗炎、抗肿瘤以及抑制细菌黏附等多重重要生物活性，在医学和生物领域需求量巨大。芳基磺基转移酶Ⅳ(aryl sulfotransferase IV,ASTⅣ)在微生物-酶法合成肝素过程中发挥着关键作用，能够促使磺基供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate, PAPS)实现高效合成与低成本再生。该研究依据密码子偏好性对ASTⅣ的密码子进行优化，构建重组表达载体pET32b-ASTⅣ,利用大肠杆菌进行异源表达。通过定点突变将半胱氨酸突变为丙氨酸，并借助分子模拟分析深入探究二硫键对ASTⅣ活性的影响。研究结果显示，与野生型ASTⅣ的k_(cat)/K_m数值(139.13±25.06 L/(s·mol)相比，突变Cys~(66)、Cys~(82)后的ASTⅣ的催化效率显著降低[k_(cat)/K_m数值分别为(80.53±23.44)、(104.85±25.17) L/(s·mol)],此外，在Origami(DE3)所产生的ASTⅣCys~(232)酶活性是BL21(DE3)产生的ASTⅣCys~(232)的1.2倍，结合分子模拟可以确定Cys~(66)与Cys~(82)之间形成了二硫键，且二硫键的折叠程度越高，越有利于ASTⅣ对PAPS的再生过程。
关键词：芳基磺基转移酶Ⅳ;;分子模拟;;定点突变;;半胱氨酸;;二硫键
基金资助：国家自然科学基金面上项目(31670120)
