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作者：毛心怡;徐岩;喻晓蔚;
单位：江南大学生物工程学院,酿造微生物与应用酶学研究室;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室;
摘要：内切多聚半乳糖醛酸酶是果胶酶中研究最为广泛的酶之一，可以特异性水解多聚半乳糖醛酸链的α-1,4-糖苷键，生成不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸，对提高果胶的附加值具有重要意义。目前关于内切多聚半乳糖醛酸酶的研究仍然较少，且其催化活力和热稳定性不佳是限制其工业化应用的主要因素。课题组前期研究获得了青霉Penicillium arizonens来源的内切多聚半乳糖醛酸酶基因pePGB,并在毕赤酵母中实现了异源表达。由于其催化活力仅处于同类酶的中等水平，该研究主要针对其催化活力进行了改造。首先对其底物结合口袋亚位点的氨基酸进行了丙氨酸突变，基于突变结果及序列比对，选择了相应的突变热点进行理性设计，筛选获得了3个酶活力提高的突变体V248L、V248R和G111R,有序叠加后获得最佳突变体G111R/V248R,比活力和催化效率(k_(cat)/K_m)分别为野生型的1.84倍和2.06倍。随后通过同源建模及分子对接分析，248位的缬氨酸突变为精氨酸后，与底物形成了两个氢键，增强了酶与底物相互作用；而G111R突变未直接对酶与底物的相互作用造成影响，但可能与248位的精氨酸存在协同作用，共同增加了底物口袋的正电性，从而提高了与负电荷底物的结合力，进而提高了酶的催化活力。该研究为该酶后续在果汁加工等行业的应用奠定了重要基础，也为理性设计提高酶催化活力提供了参考价值。
关键词：内切多聚半乳糖醛酸酶;;理性设计;;定点突变;;催化活力;;分子对接
基金资助：国家重点研发计划项目(2021YFC2100203);; 国家自然科学基金项目(32072162)
