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作者：黄新燕;孙慕娇;杜穆花;潘越;张心语;张瑶函;徐宁;刘君;鞠建松;魏亮;
单位：河北师范大学生命科学学院;中国科学院天津工业生物技术研究所;天津科技大学生物工程学院;天津科技大学食品科学与工程学院;
摘要：3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-phosphoglycerate dehydrogenase, PGDH)是L-丝氨酸生物合成途径的限速酶，是影响L-丝氨酸高效合成的关键。该研究以来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的PGDH为研究对象，通过对其酶学性质进行测试分析发现，Cg-PGDH的酶活性仅为1.98 U/mg,而且热稳定性较差，严重制约了L-丝氨酸的高效生物合成。针对这一关键问题，该研究采用定向进化和高通量筛选的方法对Cg-PGDH进行改造，提高酶的催化活性和热稳定性。通过多轮筛选，最终获得了5个催化活性显著提升的突变体，P85Q、D365Y、A389T、A183V、I231V。其中，突变体P85Q的酶活性提升了1.55倍，并显著提高了酶的温度稳定性，最适催化温度达到60℃。随后该研究对P85Q、D365Y、A389T、A183V、I231V等5个突变体的突变位点进行组合突变，获得了温度稳定性进一步提高的突变体P85Q-D365Y。通过对Cg-PGDH突变位点的三维结构解析和分子动力学模拟实验发现，尽管突变体P85Q与D365Y的突变位点不位于Cg-PGDH催化活性中心，但是可通过蛋白结构形变增强Cg-PGDH活性中心130～140区间loop的稳定性，从而增加了酶的底物亲和性和催化活性。相关研究成果为进一步解析PGDH催化机制，提高PGDH催化活性提供了重要的研究基础和方向。
关键词：谷氨酸棒杆菌;;3-磷酸甘油酸脱氢酶;;定向进化;;高通量筛选;;温度稳定性;;分子动力学模拟
基金资助：国家重点研发计划项目(2021YFC2100700)
