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作者：张慧;梁宇馨;王昕;马东旭;龚大春;吕育财;
单位：三峡大学生物与制药学院;三峡大学,生物酵素湖北省工程技术中心;三峡大学水利与环境学院;
摘要：β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, BGL)作为重要的糖苷水解酶，不仅可用于功能性活性物质的生产，改善食品风味、提升食品营养价值，还是新一代工业发酵用碳源秸秆糖生产的关键限速酶，具有重要的应用价值。为了有效改造自主筛选的非模式黑曲霉An-1产BGL活力，该研究系统优化了黑曲霉An-1原生质体的制备条件与再生方法，建立了稳定的黑曲霉An-1遗传转化体系，具体为：将固体平板培养的菌丝作为酶解材料，使用混合酶(1%纤维素+0.5%蜗牛酶+0.25%溶菌酶，质量分数)处理2 h;在STC缓冲液孵育后，采用直接抗性筛选的方式，转化子的阳性率高达100%;通过比较不同的破壁方式对菌丝PCR的影响，确定了碱裂解法的破菌效果最佳，以其裂解液作为模版的检测效率最高达97%。然后以红色荧光蛋白作为报告基因，以P_(gpd)为启动子和T_(gla)为终止子，成功过表达了带有报告基因的11条BGL基因，筛选出黑曲霉An-1的关键BGL为HQM9510。以pFC332-Cas9-sgRNA为质粒，以黑曲霉An-1基因组为模板，以kus-up-F和kus-down-R为引物获取供体片段，精准敲除kusA基因，建立了非模式黑曲霉An-1的基因组编辑体系。所构建的过表达HQM9510基因的工程菌株O9510,以纤维二糖和p-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷为底物的摇瓶酶活力分别提升至12.88 U/mL和17.10 U/mL,实现了BGL的高效表达。该研究为分子改造黑曲霉An-1以提升其产酶能力奠定了科学基础。
关键词：黑曲霉;;原生质体;;基因编辑;;β-葡萄糖苷酶;;过表达
基金资助：湖北省教育厅科学技术研究计划青年人才项目(Q20231201);; 湖北省自然科学基金创新发展联合基金项目(2024AFD178)
