来源：期刊VIP网 时间：
作者：窦培冲;戴舒春;张莲莲;苏敬允;董国明;朱梦丹;钟远广;张明义;
单位：铭诚惠众(江苏)药物研究有限公司;
摘要：该研究旨在构建蛋白内切酶Kex2表达菌株，并对其纯化过程及酶稳定性进行研究，开发适合规模化生产的整体工艺，进一步促进其工业化应用。选取酿酒酵母Kex2酶前体肽至丝氨酸苏氨酸区域进行基因合成并克隆于质粒pPICZαA中，电转化野生营养型菌株X33,通过抗生素(博来霉素)平板及菌落PCR筛选重组子，使用基础盐培养基进行了5 L罐发酵获得重组酶Kex2,通过发酵液预处理、离子交换层析获得了纯化Kex2酶，进一步研究了10%(体积分数)甘油保护、冻干粉2种形态下纯化Kex2酶的保存稳定性。菌落PCR结果显示，通过平板筛选成功获得重组菌，经过60 h甲醇诱导5 L发酵罐Kex2表达量达到2.53 g/L发酵上清液；上清液经过中空纤维柱超滤、浓缩换液后电导率明显降低，可直接用于离子交换柱上样，经一步纯化得到Kex2(比活力20.24 U/mg),相对于发酵上清液其综合收率为41.6%;保存稳定性结果显示，甘油保护及冻干粉2种形态的重组Kex2在-20℃和冷藏条件下均具有较好的稳定性，其中甘油保护的Kex2在-20℃和冷藏条件下3个月后，剩余酶活力分别为77.7%、82.9%,冻干粉在-20℃和冷藏条件下3个月后，剩余酶活力分别为86.2%、77.8%。该研究获得的Kex2表达菌株、Kex2纯化工艺及Kex2对解决该酶应用成本高等问题具有重要意义。
关键词：Kex2;;重组表达;;法夫驹形氏酵母;;纯化;;比活力;;稳定性
